Моноклональные антитела
В 1975 году ученые Георг Кёлер и Цезарь Мильштейн разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы (гибридные опухолевые клетки) образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
В системе in vitro слияние соматических клеток может быть индуцировано вирусами, например вирусом Сендай, электрическим воздействием - электрослиянием или химическим веществом - полиэтиленгликолем (ПЭГ).
Принципиальная схема получения моноклональных антител.
Мышей интенсивно иммунизировали определенным антигеном – белком, бактериальными клетками или клетками животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку, и из неё готовили взвесь клеток (с большим содержанием В-лимфоцитов).
Если к суспензии В-лимфоцитов добавить клетки плазмоцитомы и полиэтиленгликоль, то после инкубации, требующейся для слияния клеток, в системе находились следующие клетки:
· гибриды АОК и АОК (В-лимфоцитов и В-лимфоцитов),
· гибриды АОК и плазмоцитомы,
· а также оставшиеся свободными - АОК и клетки плазмоцитомы (не слившиеся).
Проблема заключалась в том, как отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных не слившихся клеток и от гибридов иной специфичности.
Для достижения этой цели разработана специальная схема, использующая отбор клеток в селективной питательной среде, т.е. в среде, с помощью которой можно выделять желаемый клон клеток.
Метаболическая селекция гибридов основана на том, что нормальные соматические клетки (В-лимфоциты) могут использовать два метаболических пути синтеза нуклеотидов (пуринов и пиримидинов): основной путь и резервный путь.
В случае основного пути синтеза de novo нуклеотидов они образуются из аминокислот и углеводных предшественников.
При резервном пути синтез нуклеотидов осуществляется из гипоксантина (пурины) или из дезокситимидина (пиримидины).
Если по каким-либо причинам основной метаболический путь синтеза нуклеотидов блокируется (например, аминоптерином), то в нормальных клетках используется резервный путь синтеза нуклеотидов. В таком случае включается в работу фермент гипоксантин-гуанидинфосфорибозилтрансфераза (Г/ГФРТ) и тимидинкиназа (ТК), что обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути.
Клетки миеломы, используемые для гибридизации с В-лимфоцитами, были отобраны мутантные, у них не синтезируется фермент Г/ГФРТ, т.е. у них имелся только основной путь синтеза нуклеотидов. Такие клетки способны синтезировать нуклеотиды только по основному метаболическому пути.
Если в среду для культивирования внести вещество, блокирующее основной путь синтеза нуклеотидов в клетке - аминоптерин, то на данной среде миеломные клетки, у которых отсутствует фермент (Г/ГФРТ), не способны обеспечить синтез нуклеиновых кислот и будут погибать.
Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток. Для решения этой задачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипоксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В таких условиях миеломные клетки погибают и остаются функционально активными только гибридомы.
В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro, они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции.
Для получения больших объемов жидкости, содержащей моноклональные антитела, гибридомы могут быть введены внутрибрюшинно мышам реципиентам. В результате в брюшной полости вырастает солидная опухоль и накапливается асцитическая жидкость, являющаяся источником моноклональных антител.
Полученные клоны можно заморозить при -700С и длительно сохранять. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам, где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны, что могут рассматриваться как чистые химические реагенты.
Таким образом, клоны-продуценты моноклональных антител (гибридомы) получают слиянием антителообразующих клеток лимфоидной ткани иммунизированного животного и клеток плазмацитомы. Полученные в результате клетки наследуют от лимфоцитов способность к секреции антител и от клеток миеломы способность к неограниченному росту in vitro.
А, В, С - многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации (или сложные антигены с множеством антигенных детерминант);
АОК - антителообразующие клетки селезенки;
Пл - клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ- среде;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин;
анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам (или антигенным детерминантам).
После недолгого культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные В-лимфоциты (АОК) смертны и быстро погибают в культуре, они не способны длительно культивироватться.
Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как аминоптерин блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а гипоксантин и тимидин их не спасали.
Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь - от нормальной клетки. Такие гибриды, гибридомы, сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела, а так же пролиферировать.
Следующий этап после получения гибридом - клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в пластиковые планшеты. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела.
В отличие от поликлональных гетерогенных сывороток, содержащих большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами, препараты моноклональных антител содержат продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте и обладающий всегда одинаковыми физикохимическими характеристиками и сродством к антигену. Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии.
Моноклональные антитела оказались исключительно удобным и широко применяемым в настоящее время диагностическим средством. С их помощью определяют маркеры клеточных популяций (фенотипирование клеток крови и в частности лимфоцитов), гормоны, медиаторы, опухолевые маркеры и т.д.
Области применения моноклональных антител:
· идентификация субпопуляций лимфоцитов человека
· истощение клеточных популяций
· выделение клеток
· установление функций молекул клеточной поверхности
· определение группы крови
· диагностика опухолей и локализация опухолей
· иммунорадиометрический анализ
· анализ сложных смесей антигенов
· анализ эмбрионального развития
· квадромы
· анализ иммунного ответа
· искусственные ферменты
«Гуманизированные» моноклональные антитела крысы, в которых генные сегменты, кодирующие все 6 участков, определяющих комплементарность (CDR), соединены с генами Ig человека в качестве основы.