Химические свойства хлорофилла

Фотосинтез

5. Пигменты листа, их химическая природа и оптические свойства, методы их выделения и разделения.

Для того чтобы свет мог оказывать влияние на растительный организм и, в частности, быть использованным в процессе фотосинтеза, необходимо его поглощение фоторецепторами-пигментами. Пигменты — вещества, имеющие окраску. Видимая часть спект­ра представлена длинами воли от 400 до 800 им. Органические ве­щества, поглощающие свет с длиной волны менее 400 им, кажутся бесцветными.

Хлорофиллы. У всех высших растений, водорослей и цианобактерий содержится хлорофилл a, хлорофилл b имеется у высших растений и зеленых водорослей. Хлорофилл с, лишенный фитола, содержится в бурых и диатомовых водорослях, хлорофилл d – в красных водорослях. Фотосинтезирующие зеленые бактерии имеют бактериохлорофиллы c и d, пурпурные бактерии - бактериохлорофиллы a и b.

У хлорофилла четыре пиррольных кольца соединены между собой метиновыми мостиками (=СН-), образуя порфириновое кольцо. Кроме того, атомы азота пиррольных колец связаны с атомом магния. С порфириновым ядром соединено циклопентановое кольцо, образованное остатком кетопропионовой кислоты и содержащее активные карбонильную (С=О) и метилированную карбоксильную (О=С-О-СН3) группы. Структура, состоящая из порфиринового ядра и циклопентанового кольца, называется форбином. Боковая цепь, состоящая из пропионовой кислоты и непредельного спирта фитола, связана с атомом углерода IV пиррольного кольца (рис. 5.1). Хлорофилл, лишенный фитола, называется хлорофиллидом. Если атом магния замещен протоном, то такое соединение носит название феофитина. Активность хлорофиллов, также как и других пигментов, обусловлена наличием большого количества двойных связей с делокализованными электронами.

Хлорофиллы хорошо растворимы в органических растворителях (этиловом эфире, бензоле, хлороформе, ацетоне, этиловом спирте) и нерастворимы в воде. Хлорофиллы имеют максимумы поглощения света в красной и синей частях спектра. Растворы хлорофиллов обладают флуоресценцией и фосфоресценцией.

Химические свойства хлорофилла

По химическому строению хлорофилл — это сложный эфир дикарбоновой органической кислоты — хлорофиллина и двух остатков спиртов — фитола и метилового. Хлорофиллин представляет собой азотсодержащее металлорганическое соединение, относящееся к магний-порфиринам. В центре молекулы хлорофилла расположен атом магния, кото­рый соединен с четырьмя азотами пиррольных группировок. В пиррольных группировках хлорофилла имеется система чередующихся двойных и простых связей. Это и есть хромофорная группа хлоро­филла, обусловливающая его окраску.

Расстояние между атомами азота пиррольных группировок в ядре хлорофилла составляет 0,25 нм. Интересно, что диаметр атома маг­ния равен 0,24 нм. Таким образом, магний почти полностью заполня­ет пространство между атомами азота пиррольных группировок. Это придает ядру молекулы хлорофилла дополнительную прочность. Еще К. А. Тимирязев обратил внимание на близость химического строения двух важнейших пигментов: зеленого — хлорофилла листьев и крас­ного — гемина крови. Действительно, если хлорофилл относится к магний-порфиринам, то гемин — к железопорфиринам. Сходство это не случайно и служит еще одним доказательством единства всего органического мира.

Одной из специфических черт строения хлорофилла является на­личие в его молекуле, помимо четырех гетероциклов, еще одной ци­клической группировки из пяти углеродных атомов — циклопентанона. В циклопептанонном кольце содержится кетогруппа, обладаю­щая большой реакционной способностью. Есть данные, что в результате процесса эполизации по месту этой кетогруппы к молекуле хло­рофилла присоединяется вода.

Извлеченный из листа хлорофилл легко реагирует как с кислота­ми, так и со щелочами. При взаимодействии со щелочью происходит омыление хлорофилла, в результате чего образуются два спирта и щелочная соль хлорофиллина. В интактном живом листе от хлоро­филла может отщепляться фитол под воздействием фермента хлорофиллазы. При взаимодействии со слабой кислотой извлеченный хлорофилл теряет зеленый цвет, образуется соединение феофитин, у которого атом магния в центре молекулы замещен на два атома водорода.

Хлорофилл в живой интактной клетке обладает способностью к обратимому окислению и восстановлению. Способность к окислитель­но-восстановительным реакциям связана с наличием в молекуле хлорофилла сопряженных двойных связей. Эти связи фиксированы не прочно, и при их перемещении азот пиррольных ядер может окис­ляться (отдавать электрон) или присоединять электрон (восстанав­ливаться).

Молекула хлорофилла полярна, ее порфириновое ядро обладает гидрофильными свойствами, а фитольный конец — гидрофобными. Это свойство молекулы хлорофилла обусловливает определенное рас­положение ее в мембранах хлоропластов. Исследования показали, что свойства хлорофилла, находящегося в листе и извлеченного из листа, различны, так как в листе он на­ходится в комплексном соединении с белком подобно гемоглобину крови. Это доказывается следующими данными: 1. Спектр поглоще­ния хлорофилла, находящегося в листе, иной по сравнению с извле­ченным хлорофиллом. 2. Хлорофилл невозможно извлечь абсолютным спиртом из сухих листьев. Экстракция протекает успешно, только если листья увлажнить или к спирту добавить воды. 3. Выделенный из листа хлорофилл легко подвергается разрушению под влиянием самых разнообразных воздействий (повышенная кислотность, кисло­род и даже свет). Между тем в листе хлорофилл достаточно устой­чив ко всем перечисленным факторам. Следует заметить, что связь между хлорофиллом и белком несколько иного характера, чем между гемином и белком. Установлено, что для гемоглобина характерно по­стоянное соотношение — на 1 молекулу белка приходится 4 молекулы гемина. Между тем соотношение между хлорофиллом и белком раз­лично (от 3 до 10 молекул хлорофилла на 1 молекулу белка). Это соотношение претерпевает изменения в зависимости от типа расте­ний, фазы их развития, условий среды. Связь между молекулами белка и хлорофиллом осу­ществляется путем нестойких комплексов, образующихся при взаимо­действии кислых групп белковых молекул и азота пиррольных колец. Чем выше содержание дикарбоновых аминокислот в белке, тем луч­ше идет их комплексирование с хлорофиллом. Блокирование карбок­сильных групп в белке сильно уменьшает его способность к связыва­нию с хлорофиллом. Белки, связанные с хлорофиллом, характеризу­ются низкой изоэлектрической точкой (3,7—4,9). Молекулярная мас­са этих белков порядка 68 тыс.

Важным свойством молекул хлорофилла является их способность к взаимодействию друг с другом. В результате этого происходит их переход из мономерной в агрегированную форму, которая может воз­никнуть в результате взаимодействия двух и более молекул при их близком расположении друг к другу. В процессе образования хлорофилла его состояние в живой клетке закономерно меняется. При этом и происходит его агрегация.

Оптические свойства хлорофилла.

Хлорофилл поглощает солнечную энергию и направляет её на химические реакции, которые не могут протекать без энергии, получаемой извне. Раствор хлорофилла в проходящем свете имеет зелёный цвет, но при увеличении толщины слоя или концентрации хлорофилла он приобретает красный цвет.

Хлорофилл поглощает свет не сплошь, а избирательно. При пропускании из семи видимых цветов, которые постепенно переходят друг в друга. При пропускании белого света через призму и раствор хлорофилла на полученном спектре наиболее интенсивное поглощение будет в красных и сине-фиолетовых лучах. Зелёные лучи поглощаются мало, поэтому в тонком слое хлорофилл имеет в проходящем свете зелёный цвет. Однако с увеличением концентрации хлорофилла полосы поглощения расширяются и без поглощения проходит только часть крайних красных.

Спектры поглощения хлорофилла а и b очень близки.

В отражённом свете хлорофилл, кажется вишнёво-красным, так как он излучает поглощённый свет с изменением длины его волны. Это свойство хлорофилла называется флюоресценцией.

Каротиноиды. Каротиноиды – жирорастворимые пигменты, присутствующие в хлоропластах всех растений. Они входят в состав хромопластов в незеленых частях растений, например, корнеплодов моркови. К каротиноидам относят 3 группы соединений: 1) оранжевые или красные каротины, 2) желтые ксантофиллы, 3) каротиноидные кислоты. Каротины и ксантофиллы состоят из 8 остатков изопрена, которые образуют цепь конъюгированных двойных связей (рис. 5.2). Основные каротиноиды - b-каротин, лютеин, виолаксантин и неоксантин.

Каротины и ксантофиллы растворимы в хлороформе, бензоле, сероуглероде, ацетоне. Каротины хорошо растворяются в эфирах, но плохо в спиртах, а ксантофиллы наоборот. Каротиноиды имеют максимумы поглощения в фиолетово-синей и синей частях спектра света. Они не способны к флуоресценции.

Главные функции каротиноидов: поглощение света в качестве дополнительных пигментов, защита молекул хлорофиллов от необратимого фотоокисления, тушение активных радикалов, участие в фототропизме, так как способствуют определению направления роста побега.

Фикобилины. Сине-зеленые и красные водоросли помимо хлорофилла а и каротиноидов содержат пигменты фикобилины. Их молекула состоит из 4 последовательных пиррольных колец (рис. 5.3). Фикобилины являются хромофорными группами глобулиновых белков фикобилипротеинов. Они делятся на 3 группы: 1) фикоэритрины – белки красного цвета, 2) фикоцианины – сине-голубые белки и 3) аллофикоцианины – синие белки. Все они обладают флуоресценцией и растворимы в воде.

Фикобилины имеют максимумы поглощения в оранжевой, желтой и зеленой частях спектра света. Это позволяет водорослям полнее использовать свет, проникающий в воду. Вода обладает светопоглощающей способностью. На глубине около 30 м полностью исчезают красные лучи, около 180 м – желтые, 320 м – зеленые, а на глубину более 500 м не проникают синие и фиолетовые лучи. Фикобилины – это дополнительные пигменты, участвующие в светособирающем комплексе. Около 90 % энергии света, поглощенного фикобилинами, передается на хлорофилл а.

У растений имеется фикобилинфитохром. Он не участвует в фотосинтезе, но является фоторецептором красного и дальнего красного света и выполняет регуляторные функции в клетках растений.

Методы выделения и разделения пигментов.

Методы выделения пигментов основаны на их способности растворяться в полярных (спирт, ацетон) и неполярных (бензин) растворителях. На основе химической природы растворителей используются методы разделения пигментов. Так же для разделения пигментов применяется метод хроматографической адсорбции, основанный на различной проницаемости пигментов через адсорбент.

1.«Разделение пигментов по методу Крауса»

Свежие листья какого-нибудь растения мелко нарезать ножницами и растереть в фарфоровой ступке в зеленую массу. Для лучшего растирания прибавить немного кварцевого песку и этилового спирта (можно использовать ацетон). К растертой массе прилить чистого этилового спирта (или ацетона) и осторожно продолжать растирать, пока спирт не окрасится в интенсивно зеленый цвет. Полученную вытяжку отфильтровать через сухой фильтр.

Налить в пробирку 4-5 мл спиртовой вытяжки, прилить к ней 6-8 мл бензина и несколько капель воды, закрыть большим пальцем и взболтать ее в течение 2-3 минут, затем дать отстояться. Жидкость в пробирке разделится на два слоя. Спиртовой нижний слой будет окрашен в желтый цвет от присутствия в нем каротина и ксантофилла, а верхний бензиновый слой будет зеленый от хлорофилла.

2.Количественное определение пигментов

Методические рекомендации по подготовке к занятию

Межклетники листа обычно заполнены воздухом, благо­даря чему при рассматривании на свет лист кажется матовом. Если произойдет инфильтрация, т. е. заполнение меж­клетников какой-либо жидкостью, то соответствующие уча­стки листа становятся прозрачными.

Определение состояния устьиц методом инфильтрации основано на способности жидкостей, смачивающих клеточ­ные стенки, проникать в силу капиллярности через откры­тые устьичные щели в ближайшие межклетники, вытесняя. По них воздух, в чем легко убедиться по появлению на листе прозрачных пятен. Жидкости проникают в устьичные щели. В зависимости от их ширины: петролейный эфир — через слабо открытые устьица, ксилол — через средне открытые, а этиловый спирт — только через широко открытые. Данный метод очень прост и вполне применим даже в полевых условиях.

Ход работы. На нижнюю поверхность листа нанести отдельно маленькие капли петролейного эфира, ксилола и эти­лового спирта. Держать лист в горизонтальном положении до полного исчезновения капель, которые могут либо испа­риться, либо проникнуть внутрь листа, и рассмотреть лист на свет.

Исследовать листья, выдержанные в разных условиях (свежье и подвядшие, освещенные и затемненные и т. п.). Каждый раз исследовать 2—3 листа.

3.Метод хроматографии основан на различной подвижности (Rf) каждого компонента на определенном адсорбенте. Адсорбент – твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы. В качестве адсорбентов могут быть использованы сахароза, окись магния, крахмал, силикагель, бумага и т.д. Подвижность вещества зависит от его растворимости в растворителе, пропускаемом через адсорбент, и адсорбируемости на данном адсорбенте. Чем выше растворимость пигмента в растворителе и чем хуже он адсорбируется на адсорбенте, тем больше его подвижность, тем дальше он будет расположен от стартовой полосы. Применяя разные комбинации растворителей и адсорбенты различной природы, можно добиться высокой степени разделения и очистки пигментов.

Одним из адсорбентов при хроматографии является бумага. Хроматографирование на бумаге выполняют восходящим и нисходящим способами. При восходящей хроматографии бумажную полосу подвешивают вертикально; при этом нижний ее конец, на который нанесена смесь пигментов, погружают в растворитель. По мере движения растворителя под действием капиллярных сил вертикально вверх происходит разделение растворенных веществ.

При нисходящей хроматографии верхний конец бумажной полосы со смесью пигментов, нанесенных недалеко от кромки бумаги, закрепляют в лотке, который размещают в верхней части камеры. Нижний конец бумаги располагается так, чтобы он не касался налитого на дно камеры растворителя. В результате действия капиллярных сил и силы тяжести растворитель начинает передвигаться вниз по бумажной полосе, в результате чего смесь разделяется.

Хроматографирование выполняют в герметично закрытых сосудах, где поддерживают насыщенную парами растворителей атмосферу, что предотвращает их испарение с бумаги. Для эффективного разделения пигментов бумага должна быть равномерной толщины и достаточно плотной.

4.В основе классического адсорбционного метода разделения пигментов по М. С. Цвету лежат различия в степени адсорбции данных веществ адсорбентом и растворимости их в соответствующих растворах. Адсорбент – твердое вещество, способное удерживать на своей поверхности молекулы. Если смесь пигментов листа и растворителей пропустить через колонку с пористым материалом, то отдельные пигменты будут располагаться на разных уровнях колонки, давая своеобразный спектр распределения, соответствующий их адсорбционному сродству. Чем слабее сродство пигмента к адсорбенту, тем ниже пигмент будет концентрироваться. Последующим промыванием чистыми растворителями получают хроматограмму с четким разделением адсорбированных веществ на зоны.