Селективность и разрешение

ХРОМОТОГРАФИЯ

Хроматография — это физико-хими- ческий метод разделения веществ, основанный на распределении компонен­тов между двумя фазами — неподвижной и подвижной. Неподвижной (ста­ционарной) фазой обычно служит твердое вещество (его часто называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвиж­ная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через непод­вижную фазу.

Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой передви­гаются вдоль стационарной фазы. Последнюю обычно помещают в стеклян­ную (или металлическую) трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо еще механизму) компоненты перемещаются вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты остаются в верхнем слое сорбента, другие, с меньшей степенью взаимодействия с сорбентом, оказываются в нижней части колонки, некоторые покидают колонку вместе с подвижной фазой. Таким образом компоненты разделяются.

Метод позволяет разделять многокомпонентную смесь, идентифицировать компоненты и определять ее количественный состав.

Классификация хроматографических методов

В основу общепринятых классификаций многочисленных хроматогра­фических методов положены следующие признаки: агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз, механизм взаимодействия сорбент—сорбат, форма слоя сорбента (техника выполнения), цель хроматографирования.

По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую, жидкостную и сверхкритическую флюидную. Газовая хроматогра­фия включает газожидкостную и газотвердофазную, жидкостная — жидко­стно-жидкостную, жидкостно-твердофазную и жидкостно-гелевую. Известна флюидно-жидкостная хроматография. Первое слово в названии метода ха­рактеризует агрегатное состояние подвижной фазы, второе — неподвижной.

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматографии: распределительная хроматогра­фия основана на различии в растворимости разделяемых веществ в непод­вижной фазе (газожидкостная хроматография) или на различии в раствори­мости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах; ионообменная хроматография — на разной способности веществ к ионному обмену; ад­сорбционная хроматография — на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом; эксклюзионная хроматография — на различии в разме­рах и формах молекул разделяемых веществ, аффинная хроматография — на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологиче­ских и биохимических процессов.

По технике выполнения выделяют колоночную хроматогра­фию, когда разделение проводится в специальных колонках, и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится на специальной бумаге (бу­мажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хрома­тография).

Подвижную фазу, вводимую в слой неподвижной фазы, называют элю- ентом, а подвижную фазу, выходящую из колонки и содержащую разделен­ные компоненты, — элюатом. В элюате тем или иным способом определяют содержание компонентов. Распределение разделяемых веществ в виде от­дельных полос (зон) вдоль колонки представляет собой внутреннюю хрома­тограмму (рис. 8.2). Графическое изображение (часто получаемое с помо­щью самописца) распределения веществ в элюате называют внешней хроматограммой, или просто хроматограммой.

По способу получения хроматограмм различают элюентную, вытеснительную и фронтальную хроматографии.

Элюентная (проявителъная) хроматография. Хроматографическую колонку промывают элюентом (раствором или растворителем), обладающим меньшей сорбируемостью, чем любое из разделяемых веществ. Затем в ко­лонку вводят разделяемые вещества, растворенные в элюенте, и продолжают непрерывно пропускать элюент (процесс элюирования). При этом разделяе­мые вещества перемещаются вдоль колонки с разными скоростями, напри­мер, в соответствии с их сорбируемостью. Если скорости перемещения ком­понентов достаточно различаются, то на выходе из колонки сначала появля­ется наименее сорбируемый компонент, затем следующий компонент и т. д. В этом случае хроматограмма представляет собой несколько пиков, имею­щих форму гауссовой кривой.

Хроматографические параметры

На рис. 8.3 представлена идеализированная хроматограмма смеси двух веществ. По оси абсцисс отложено время хроматографирования (можно от­ложить объем элюата), по оси ординат — аналитический сигнал, зависящий от концентрации веществ в элюате (отклик А). Рассмотрим основные хрома­тографические параметры, характеризующие поведение вещества в колонке. Время от момента ввода анализируемой пробы до регистрации максимума пика называют временем удерживания (элюирования) t_R. Время удержива­ния складывается из двух составляющих — времени пребывания вещества в подвижной t_m и неподвижной t_s фазах:

Значение t_m фактически равно времени прохождения через колонку не-

сорбируемого компонента. Значение t_R не зависит от количества пробы, но

зависит от природы вещества и сорбента, а также упаковки сорбента и может меняться от колонки к колонке. Поэтому для характеристики истиной удержи­вающей способности следует ввести исправленное время удерживания t'_R:

Для характеристики удерживания часто используют понятие удержи­ваемого объема V_R — объем подвижной фазы, который нужно пропустить через колонку с определенной скоростью, чтобы элюировать вещество:

где/⁷— объемная скорость потока, см³•с^-1.

Объем для вымывания несорбируемого компонента, мертвый объем, выражается через t_m: V_m = t_mF, и включает в себя объем колонки, не заня­тый сорбентом, объем коммуникаций от устройства ввода пробы до колонки и от колонки до детектора. Исправленный удерживаемый объем соответст­венно равен

При постоянных условиях хроматографирования (скорость потока, дав­ление, температура, состав фаз) значения t_R и V_R строго воспроизводимы и могут быть использованы для идентификации веществ.

Количество вещества, вымываемого из колонки, можно найти по пло­щади под кривой элюирования:

т= jcdV

о

где с — концентрация, ммоль/мл; V— объем, мл.

Полезным параметром в хроматографии может быть коэффициент удерживания (замедления) R — отношение скорости движения вещества к скорости движения подвижной фазы:.

Для неудерживаемого вещества t_R - t_m и R =1. Если время пребывания в подвижной и неподвижной фазах одинаково (t_m = t_s), то R = 0,5. Очевидно, что R можно выразить через V_R:

(8.6)

Любой процесс распределения вещества между двумя фазами характе­ризуют коэффициентом распределения D (см. гл. 7). В данном случае D = c_s/c_m, где с_т и c_s — концентрации вещества в подвижной и непод­вижной фазах соответственно. Коэффициент распределения связан с хрома­тографическими параметрами. Действительно, отношение времени пребыва­ния вещества в неподвижной и подвижной фазах равно отношению коли­честв вещества в фазах cV:

При хроматографировании одновременно происходит разделение ве­ществ и размывание хроматографических пиков разделяемых веществ, при­водящее к ухудшению разделения. Остановимся на теоретических подходах, объясняющих эти два противоположных процесса хроматографии. Теория хроматографии призвана выявить причины размывания пиков и прогнозиро­вать эффективность разделения смеси веществ.

Хроматографическое разделение определяется различной сорбцией компо­нентов смеси, что связано с природой сорбента и разделяемых веществ. На осно­вании сведений по термодинамике сорбции (адсорбции, растворения или ионного обмена) можно судить о возможности разделения смеси веществ. Теоретический подход, объясняющий размывание, основан на изучении форм изотерм сорб­ции — графической зависимости количества вещества в неподвижной фазе c_s от его концентрации в подвижной фазе с_т при постоянной температуре. Изотерма может быть линейной (а), выпуклой (б) или вогнутой (в) (рис. 8.4). Угол наклона изотермы определяется коэффициентом распределения

Теория теоретических тарело к

Теория теоретических тарелок, общая для всех многостадийных процес­сов (например, противоточной экстракции), впервые была предложена для описания процесса дистилляции, Мартин и Синдж распространили ее на хроматографические системы. Теория основана на некоторых допущениях:

колонка состоит из определенного числа теоретических ступеней (таре­лок); 2) равновесие на каждой тарелке считается достигнутым до того, как подвижная фаза переместится на следующую тарелку, т. е. равновесие уста­навливается мгновенно; 3) на любой тарелке в любой момент времени число молекул (ионов) сорбируемых компонентов пробы значительно меньше, чем число сорбируемых молекул (ионов) элюента, т. е. вводимая проба должна быть малой, а изотерма — линейной; 4) все протекающие в колонке процес­сы рассматриваются как взаимно независимые.

Теоретическая тарелка —

это гипотетическая зона, высота которой соответствует достижению равно­весия между двумя фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, т. е. чем большее число раз устанавливается равновесие, тем эффективнее колонна. Эффективность колонки — это характеристика качества колонки, определяемая числом теоретических тарелок и высотой теоретической та­релки. Так как хроматографический процесс непрерывен и неравновесен, то представление о теоретической тарелке в хроматографии имеет умозритель­ный, формальный характер. Эта теория позволяет описать движение зоны с максимальной концентрацией компонента, экспериментально оценить ши­рину полосы (степень размывания хроматографической полосы) и эффек­тивность колонки.

Количественной мерой эффективности хроматографической колонки служат высота Н, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ), и число тео­ретических тарелок N.

Теория теоретических тарелок дает возможность сравнить эффектив­ность различных колонок, оценить качество сорбента и заполнения колонки. Однако эта теория не позволяет выявить зависимость N и Н от скорости под­вижной фазы, природы и зернения сорбента, не может дать практических рекомендаций, позволяющих избежать размывания хроматографических пиков.

Схема хроматографа

Хроматографическое разделение осуще­ствляют в приборах — хроматографах, блок- схема хроматографа приведена на рис. 8.8. В современных хроматографах широко приме­няют микропроцессоры и ЭВМ. Основной узел хроматографа — колонка. Колонки бы­вают металлические, стеклянные и пластико­вые. Количество вещества, выходящего из колонки, регистрируют с помощью детектора, сигналы которого записывают в виде хромато­грамм.

Современный хроматограф может включать несколько колонок и различные детекторы, а также автоматическое устройство для подготовки и ввода пробы. Подсоединенный к хроматографу компью­тер, имеющий запоминающее устройство и банк хроматографических данных, обеспечивает анали­тика богатой информацией.

Быстрое внедрение запоминающих устройств и мощных процессоров в хроматографическую технику дает возможность значительно усовершенствовать идентификацию и коли­чественную обработку хроматографических пнков. Для этого необходима строгая слаженность работы всей хроматографической схемы: от ввода пробы, правильного заполнения колонки, разумного выбора подвижной фазы и детектора. Кроме того, необходима автоматизация всего хроматографического процесса, которая устраняет субъективные ошибки, увеличивает скорость обработки результатов.

Селективность и разрешение

Хроматографическое разделение основано на селективности сорбента и различии в термодинамических свойствах хроматографируемых веществ в системе сорбент—элюент. Для решения вопроса о возможности хроматогра­фического разделения смеси на индивидуальные вещества нужно сопоста­вить их хроматографические параметры. Для этого используют коэффици­ент селективности а и разрешение R_s. Коэффициент селективности явля­ется мерой относительного удерживания или относительной подвижности разделяемых веществ:

Это термодинамическая характеристика, зависящая при постоянной темпе­ратуре только от природы разделяемых соединений и свойств подвижной и неподвижной фаз.

При а = 1 разделение соединений в данных условиях невозможно. Только вещества с разными D будут перемещаться вдоль колонки с разными скоростя­ми, что и приводит к их хроматографическому разделению.