Современные молекулярно-генетические методы включают в себя большую группу методов, направленных на выявление вариаций в структуре ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки нуклеотидной последовательности ДНК. В основе этих методов лежат разработанные технологии исследования ДНК и РНК. Современные методы молекулярной диагностики изучать практически любой фрагмент ДНК человека. В тех ситуациях, когда известно, какое именно поражение ДНК приводит к наследственному заболеванию, исследуется непосредственно фрагмент ДНК, содержащий повреждение – прямой метод ДНК-диагностики. Когда локализация повреждения неизвестна, используется другой подход, связанный с изучением окрестности гена, ответственного за генное заболевание в сочетании с семейным анализом, то есть используется косвенный метод.
ДНК-диагностика основана на методах, позволяющих идентифицировать строго определенный фрагмент ДНК. Это достигается с помощью блот-гибридизации. Блот-гибридизация – высокочувствительный метод, позволяющий обнаружить последовательность ДНК в количестве нескольких пикограмм. Общие принципы этой диагностики включают:
1 этап. Забор крови из вены и выделение ДНК из клеток крови; накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции. Для ДНК-диагностики наследственного заболевания не требуется исследовать всю выделенную ДНК, а достаточно изучения небольшого фрагмента генома. Однако для этого необходимо иметь большое количество копий таких фрагментов. Для получения этого количества проводится амплификация (умножение, многократное увеличение, в миллионы раз) анализируемого фрагмента ДНК за счет полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР позволяет за короткое время (несколько часов) получить более 1 млн. копий выделенного фрагмента ДНК. Единственным условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемого фрагмента.
|
|
2 этап – рестрикция (разрезание) ДНК на фрагменты. Это осуществляется с помощью особых ферментов рестриктаз, которые разделяют ДНК в строго определенном месте. В результате образуется набор фрагментов ДНК различной длины.
3 этап – электрофорез фрагментов ДНК на агарозном геле (или полиакриламидном геле). Поскольку фрагменты различной длины и молекулярного веса, их движение по гелю будет неодинаковым – более тяжелые будут двигаться медленнее, чем более легкие. Распределение фрагментов на геле будет в виде полос, форма и размеры которых сравниваются со стандартными образцами ДНК, размеры которых известны.
4 этап. Поскольку полосы визуально не определяются, возникает необходимость из визуализации и идентификации. С этой целью после окончания электрофореза гель обрабатывается красителем (чаще этидия бромидом, но могут использоваться и другие), который связывается с ДНК. При ультрафиолетовом облучении поверхности геля он начинает светиться красным цветом. Разработаны методы автоматической регистрации этого процесса.
5 этап – включает определение нуклеотидной последовательности исследуемого фрагмента ДНК (секвенирование), который сравнивается с нормой, и затем формулируется окончательный генетический диагноз.
|
|
Выделяют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.
С помощью прямых методов выявляются нарушения в первичной нуклеатидной последовательности ДНК (мутации и их типы). Прямые методы отличаются точностью, достигающей почти 100%. Однако на практике указанные методы могут применяться только при определенных условиях: 1) при известной цитогенетической локализации гена, ответственного за развитие наследственного заболевания; 2) должен быть клонированным ген заболевания и известна его нуклеотидная последовательность.
Целью прямой диагностики является идентификация мутантных аллелей. Но к настоящему времени гены многих заболеваний не картированы и многие наследственные болезни отличаются выраженной генетической гетерогенностью, что не позволяет в полной мере использовать прямые методы ДНК-диагностики. В связи с этим применяют косвенные методы молекулярно-генетической диагностики наследственных заболеваний.
Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сцепления с исследуемым геном определенного полиморфного локуса (маркера), с помощью которого можно производить маркировку как мутантных, так и нормальных аллелей и анализировать их передачу в поколениях, то есть среди родственников обследуемого лица. Это особенно важно при решении вопроса о пренатальной диагностике наследственного заболевания.
Большие перестройки генома (делеции, инсерции, дупликации, транслокации) размером более 1 Мв, затрагивающие целые гены или несколько генов, могут определяться цитогенетическим анализом на прометафазных хромасомах. Эффективност выявления этих нарушений может повышаться при исследовании клеток в интерфазах с использованием флюоресцентной гибридизации in situ (FISH-метод).
|
|
Для выявления точковых мутаций и небольших делеций используется различные способы, однако все они основаны на применении метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей многократно умножить нуклеотидную последовательность ДНК, а затем осуществить поиск мутации. Методы поиска фрагментов ДНК, несущих мутации, основаны на сравнительном анализе мутантных и нормальных нуклеотидных последовательностей ДНК. Точковые мутации могут идентифицироваться только при наличии ДНК-зондов.
ДНК-зонды – это клонированные последовательности геномной ДНК, изолированные из области локализации гена. Они тесно сцеплены с геном и даже являются его фрагментом. С помощью ДНК-зондов могут быть также выявлены и полиморфные локусы, которые, в свою очередь, могут использоваться как генетические маркеры определенных участков хромосом.
Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в пренатальной диагностике практически для всех моногенных заболеваний. Однако для диагностики требуется обследование как можно большего числа родственников (в первую очередь, родители-дети), чтобы проследить путь передачи маркеров потомству. Это повышает информативность выбранного маркера.