Существует количественная связь между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции

На рис.2. показана кривая, характе­ризующая зависимость скорости фер­ментативной реакции от концентрации субстрата. Из рисунка видно, что но этой кривой, которая только приближается к точке, соответствующей максимальной скорости реакции, но никогда ее не до­стигнет, трудно определить точно, при какой концентрации субстрата устана­вливается Vmax. Однако благодаря тому, что эта кривая, представляющая собой гиперболу, имеет одинаковую форму для большинства ферментов, Михаэлис и Ментен определили константу, обозна­чаемую в настоящее время через Км, при помощи которой удобно выражать точное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью катализируемой ферментом реакции. Величину Км, иначе константу Михаэлиса-Ментен, можно определить просто как концентрацию специфического субстрата, при которой данный фермент обеспечивает скорость реакции, равную половине ее максималь­ной скорости (рис.2.).

Характерная форма кривой насыщения фермента субстратом (рис.2.) может быть выражена математически уравне­нием Михаэлиса—Ментен

 

 

 

где ʋ₀ начальная скорость при концен­трации субстрата [S], Vmax - максималь­ная скорость и Км- константа Михаэлиса-Ментен для данного фермента, со­ответствующая определенному субстра­ту.

Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен

Для многих ферментов характерна гиперболическая кривая зависи­мости скорости реакции от концентрации субстрата (рис.2), посте­пенно приближающаяся к точке, соответствующей насыщению фер­мента субстратом. Мы уже видели, что такие кривые имеют две основные точки: 1) Км-концентрация субстрата, при которой ско­рость реакции равна половине ее максимальной скорости, и 2) Vmax ^_максимальная скорость, т.е. предельное значение, к которому приближается скорость реакции при бесконечно большой концентра­ции субстрата. Михаэлис и Ментен показали, что из гиперболических кривых насыщения ферментов можно извлечь много дополнительной полезной информации, если перевести их в простую математическую форму. Уравнение Михаэлиса-Ментен представляет собой алгебраиче­ское выражение гиперболической формы таких кривых. Членами этого важнейшего уравнения являются: концентрация субстрата S, началь­ная скорость ʋ_0, Vmax и Км. Уравнение Михаэлиса- Ментен лежит в ос­нове всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитывать количественные характеристики фермен­тов и проводить анализ их ингибирования.

Теперь мы рассмотрим подробнее основные логические и алгебраи­ческие этапы, через которые проходит вывод уравнения Михаэлиса— Ментен на современном уровне. Прежде всего напишем две основные реакции образования и распада фермент-субстратного комплекса

Введем следующие обозначения: [Et]-общая концентрация фермента (суммарное количество свободного и связанного фермента), [ES] - кон­центрация фермент-субстратного комплекса и [Еt] — [ES] - концентрация свободного, т. е. несвязанного, фермента. По­скольку концентрация субстрата [S] обычно гораздо больше, чем [E_t], количество субстрата S, связанного с ферментом Е в любой момент времени, можно считать пренебрежимо малым по сравнению с общим количеством субстрата S. Вывод уравнения начинается с определения скоростей образования и распада фермент-субстратного комплекса ES.

1. Скорость образования ES. Скорость образования ES в реакции (а)
равна

где к₁ - константа скорости реакции (а). Скорость образования ES из Е + Р в обратной реакции (б) очень мала по сравнению со скоростью прямой реакции и поэтому ею можно пренебречь.

2. Скорость распада ES. Скорость распада ES равна

где к-₁ и к₂- константы скорости соответственно обратной реак­ции (а) и прямой реакции (б).

3.

Стационарное состояние. Когда скорость образования фермент-
субстратного комплекса ES равна скорости его распада, концентрация ES постоянна, и реакция протекает в стационарном режиме:

4. Разделение констант скоростей. Преобразование левой части урав-
нения (г) дает

При упрощении его правой части получаем .

Следовательно,

Если перенести член- в правую часть уравнения и изме­нить его знак, то получим

Дальнейшее упрощение дает

Теперь мы можем решить это уравнение относительно [ES]

Это уравнение можно упростить, объединив константы скоростей в одном уравнении:

гряп

5. Определение начальной скорости v₀ через [ES] Согласно теории Михаэлиса-Ментен, начальная скорость определяется как скорость распада фермент-субстратного комплекса, т. е. скорость реакции (б), константа скорости которой равна к₂. Таким образом, мы можем написать

Поскольку, однако, величина [ES] равна правой части уравнения (д), мы имеем:

Полученное уравнение можно упростить, если обозна­чить через Км (константа Михаэлиса-Ментен), а к₂ [Еt]- через Vmax*Vmax -это максимальная скорость реакции, наблюдаемая в ус­ловиях, когда весь фермент Е находится в форме фермент-субстрат­ного комплекса ES. Подставив эти две величины в уравнение (е), получим:

Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен, т.е. уравнение скорости односубстратной ферментативной реакции. Оно выражает количе­ственное соотношение между начальной скоростью реакции v₀, макси­мальной скоростью реакции V_max и исходной концентрацией субстра­та, связанных между собой через константу Михаэлиса-Ментен Км.

В специальном случае, когда начальная скорость реакции в точности равна половине максимальной скорости, т.е. когда

(рис. 9-4), можно, исходя из уравнения Михаэлиса-Ментен, получить важное численное соотношение:

Если разделить обе части этого уравнения на Vmax, то будем иметь

Решая это уравнение относительно Км, получаем:

К_М + [S] = 2[S]

Км = [S] (при условии, что v₀ точно равно 1/2Vmax)

Уравнение Михаэлиса-Ментен можно преобразовать алгебраиче­ским способом и выразить в виде ряда эквивалентных уравнений, ко­торые полезны для практического определения величин Км и V_max и используются также при изучении действия ингибиторов.

Теория Михаэлиса-Ментен позволяет количественно описать большинство ферментативных реакций, включая реак­ции с участием двух или более субстратов. Это служит еще одним убеди­тельным подтверждением того, что фер­менты катализируют реакции, временно присоединяясь к своим субстратам, в результате чего снижается энергия актива­ции всей реакции в целом. Образование фермент-субстратных комплексов можно доказать с помощью прямых физико- хи­мических методов, например по харак­терным изменениям спектра поглоще­ния фермента при добавлении суб­страта.

­ Преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен: график в двойных обратных координатах

 

Уравнение Михаэлиса - Ментен

можно преобразовать алгебраическим способом в другие формы, бо­лее удобные для анализа экспериментальных данных. Одно часто при­меняемое преобразование состоит просто в том, что обе части уравне­ния Михаэлиса-Ментен (а) выражают в виде обратных величин

Разделив числитель в правой части уравнения на его составляющие, получаем

Упрощение этого уравнения дает

Уравнение (б), представляющее собой преобразованное уравнение Ми­хаэлиса - Ментен, называется уравнением Лайнуивера - Бэрка. Для фер­ментов, строго подчиняющихся кинетике Михаэлиса - Ментен, зависимость 1 /v₀ от 1[S] выражается прямой линией (рис.3).

Тангенс угла наклона этой линии численно равен величине Км/Vmax, отрезок, отсе­каемый на оси ординат,-величине 1/Vmax, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс,- 1 /Км- График, построенный в двойных обратных координа­тах (график Лайнуивера - Бэрка) имеет то преимущество, что позво­ляет более точно определить величину V_mах, которая на графике зависимости v₀ от [S] может быть лишь аппроксимирована (как пока­зано на рис. 4). Существуют и другие способы преобразования уравне­ния Михаэлиса - Ментен. Каждый из них имеет свои преимущества при исследовании кинетики ферментативных реакций.

Как мы увидим дальше, графики в двойных обратных координатах с большой пользой применяются также при изучении ингибирования ферментативных реакций.

Величина Kм-это ключевой пункт уравнения Михаэлиса-Ментен. Она характеризует поведение данного фермента по отношению к тому или иному суб­страту при определенных значениях тем­пературы и рН. Приблизительное значе­ние Kм можно получить простым графическим способом, как показано на рис.2 Однако из кривой такого типа трудно определить точно величину Vmах, поскольку эта величина соответствует точке, к которой стремится кривая, но ко­торую она никогда не достигнет. Исполь­зуя алгебраические преобразования урав­нения Михаэлиса-Ментен можно получить более точное значение Kм из графика, по­строенного по тем же данным, но в других координатах, называемых двойными обратными координатами.

Ферменты, имеющие два или более суб­страта, такие, как гексокиназа или аспартатаминотрансфераза, катализирующая обратимую реакцию

 

 

могут иметь различные значения Км для разных субстратов.

В тех условиях, которые существуют в клетке, ферменты обычно не насыщены субстратом и, значит, функционируют, как правило, не с максимально возможными скоростями. Изменяя внутри­клеточные концентрации субстратов, можно в какой-то степени регулировать скорость ферментативных реакций в клетке.