Молекулы белков представляют собой линейные полимеры, состоящие из α-L-аминокислот(которые являются мономерами) и, в некоторых случаях, из модифицированных аминокислот Белки длиной от 2 до нескольких десятков аминокислотных остатков часто называют пептидами, при большей степени полимеризации — белками, хотя это деление весьма условно.
Последовательность аминокислот в белке соответствует информации, содержащейся в гене данного белка. Эта информация представлена в виде последовательности нуклеотидов, причём одной аминокислоте соответствует в ДНК последовательность из трёх нуклеотидов — так называемый триплет или кодон. Такой трёхкодонный код сложился эволюционно рано. Но существование различий в некоторых организмах, появившихся на разных эволюционных стадиях, указывает на то, что он был не всегда таким.
Согласно некоторым моделям, сначала код существовал в примитивном виде, когда малое число кодонов обозначало сравнительно небольшое число аминокислот. Более точное значение кодонов и большее число аминокислот могли быть введены позже. Сначала только первые два из трёх оснований могли быть использованы для узнавания [что зависит от структуры тРНК].
Свойства белков-Растворимость. По способности растворяться белки делятся на растворимые и нерастворимые. К растворимым относится белок куриного яйца. Не могут растворяться белки шерсти, перьев, ногтей.
Гидролиз. При действии воды в присутствии кислоты или ферментов белки подвергаются гидролизу. В результате расщепления белковых молекул водой образуется смесь аминокислот. Такой процесс происходит в органах пищеварения при переваривании белковой пищи. Получившиеся аминокислоты всасываются в кровь и используются организмом для синтеза собственных белков.
Денатурация — разрушение пространственной структуры белка. Она происходит при нагревании белков, под действием радиоактивного излучения, некоторых химических веществ (кислот, щелочей, солей тяжёлых металлов). При денатурации белки изменяют свои свойства и теряют биологическую активность, несмотря на то, что их первичная структура сохраняется. Примером денатурации служит изменение яичного белка при нагревании.
Функции белков. В каждом живом организме содержится большое количество белков, которые выполняют ряд важнейших функций. Белки входят в состав цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, органоидов и тем самым выполняют строительную функцию в живых организмах.
Важнейшая функция белков — защитная. Особые белки — антитела и антитоксины — участвуют в формировании иммунитета. Антитела обезвреживают проникшие в организм бактерии, а антитоксины нейтрализуют их яды.
Белок гемоглобин выполняет транспортную функцию. Он переносит кислород от органов дыхания к тканям. Двигательная функция некоторых белков обеспечивает сокращение мышц и все движения живых организмов. При нехватке пищи белки могут выполнять энергетическую функцию. Белки выполняют сигнальную, рецепторную, регуляторную и другие функции.
45)16)17) Особенности пространственной организации ДНК. Свойства и функции. В изолированном хроматине участки двойной спирали ДНК обвиваются вокруг молекул гистонов, так что здесь возникает суперспираль первого порядка. Комплексы ДНК с гистоном называют нуклеосомами. Они имеют форму диска или линзы и размеры около 10 x 10 x 5 нм. В одну нуклеосому входят:8 молекул гистонов:центральный тетрамер из двух молекул Н3 и двух Н4;и отдельно по два Н2а и Н2в);участок ДНК (около 140 пар оснований), который образует примерно 1,25 витка спирали и прочно связан с центральным тетрамером.
Между нуклеосомами лежат участки спирали из 30-100 пар оснований без суперспиральной структуры; здесь связывается гистон Н1.
В нативном хроматине ДНК еще больше укорочена в результате малоизученной дальнейшей спирализации (суперспирали высших порядков), которая, очевидно, фиксируется благодаря гистону Н1 (и некоторым негистоновым белкам). При переходе к интерфазе происходит разрыхление эухроматина, так как некоторые из суперспиралей более высокого порядка раскручиваются. Это происходит, вероятно, в результате конформационных изменений гистонов и ослабления взаимодействий между молекулами Н1. Хроматиновые структуры толщиной 10-25 нм (основные хроматиновые нити или спирали) видны и во время интерфазы.
Транскрипционно-активный хроматин - гены, передающие свою информацию путем синтеза РНК, в результате дальнейшей деспирализации еще больше разрыхляется. По некоторым данным, в соответствующих участках спирали ДНК гистон Н1 или отсутствует, или химически изменен, например, фосфорилирован.
Структура нуклеосом также изменяется или полностью разрушается (в генах для р-РНК в ядрышке). Двойная спираль в отдельных местах раскручивается. В этих процессах, по-видимому, участвуют определенные негистоновые белки, скапливающиеся в транскрипируемых участках ДНК
Структура ДНК. ДНК является молекула полимера с четырьмя типами основных химических веществ. Они содержат: сахар (Дезоксирибоза), отрицательно заряженные фосфатной группы основы: аденин (А) цитозин (C) гуанин (Г) тимин (Т)
Нуклеотидов связаны между собой узами ковалентный Фосфодиэфирная.
Есть водородных связей между большой пуриновых базы (A или C) одна прядь и небольшой пиримидина базы (T или C) на другой цепи. База пара последовательность обычно называют первичной структуры ДНК. Эта последовательность определяет фактические структуру ДНК. ДНК несет генетический код, и это то, что читается механизм синтеза белка, когда он делает новые белки. Отношения между ДНК и белков является жизненно важным для живых организмов. Белок является обильные и сложные молекулы, найденные в теле. Это может быть важно для формирования структуры тела (структурных белков), посыльных, ферменты, гормоны и др. ДНК может иметь различные формы и длины. В физиологических условиях ДНК находится в так называемой форме B правосторонней спирали double-stranded. Есть повторить поворот или спирали после каждого 10.4 низкопробных пар или вокруг 34nanometers. Толщина ДНК о 2нм и низкопробной пар толщина составляет около 0.34nm. Как витая нитей ДНК они имеют различные пазы. ДНК имеет два вида канавки, которые играют важную роль в его функционировании. Крупные и мелкие канавки помочь в формировании различных белков. Эти канавки связывать белки как факторы транскрипции, которые приводят к образованию белков. ДНК могут присутствовать в нескольких различных конформации и они важны для ДНК функции и действия. Конформации ДНК имеют жизненно важное значение для ремонта поврежденной ДНК, потому что они действуют с ферментов в организме. Нити ДНК, как телефонный кабель или веревкой. Это намотка является свойством Центральный ДНК. ДНК может быть в расслабленной или спиральный государства. Намоточные помогает чрезвычайно длинные нити ДНК вписывается крошечные клеточного ядра. Проще говоря, это суперскрученности свойство делает ДНК более эффективным, упаковки в больше информации в небольших пространствах.
46.Митохондриальная ДНК. Свойства и функции. Находящаяся в матриксе митохондриальная ДНК представляет собой замкнутую кольцевую двуспиральную молекулу, в клетках человека имеющую размер 16569 нуклеотидных пар, что приблизительно в 105 раз меньше ДНК, локализованной в ядре. В целом митохондриальная ДНК кодирует 2 рРНК, 22 тРНК и 13 субъединиц ферментов дыхательной цепи, что составляет не более половины обнаруживаемых в ней белков. В частности, под контролем митохондрального генома кодируются семь субъединиц АТФ-синтетазы, три субъединицы цитохромоксидазы и одна субъединица убихинол-цитохром-с-редуктазы. При этом все белки, кроме одного, две рибосомные и шесть тРНК транскрибируются с более тяжёлой (наружной) цепи ДНК, а 14 других тРНК и один белок транскрибируются с более лёгкой (внутренней) цепи.
На этом фоне геном митохондрий растений значительно больше и может достигать 370000 нуклеотидных пар, что примерно в 20 раз больше описанного выше генома митохондрий человека. Количество генов здесь также примерно в 7 раз больше, что сопровождается появлением в митохондриях растений дополнительных путей электронного транспорта, не сопряжённых с синтезом АТФ.
Митохондриальная ДНК реплицируется в интерфазе, что частично синхронизировано с репликацией ДНК в ядре. Во время же клеточного цикла митохондрии делятся надвое путём перетяжки, образование которой начинается с кольцевой бороздки на внутренней митохондриальной мембране. Детальное изучение нуклеотидной последовательности митохондриального генома позволило установить то, что в митохондриях животных и грибов нередки отклонения от универсального генетического кода. Так, в митохондриях человека кодон ТАТ вместо изолейцина в стандартном коде кодирует аминокислоту метионин, кодоны ТСТ и ТСС, обычно кодирующие аргинин, являются стоп-кодонами, а кодон АСТ, в стандартном коде являющийся стоп-кодоном, кодирует аминокислоту метионин. Что касается митохондрий растений, то, по-видимому, они используют универсальный генетический код. Другой чертой митохондрий является особенность узнавания кодонов тРНК, заключающаяся в том, что одна подобная молекула способна узнавать не один, но сразу три или четыре кодона. Указанная особенность снижает значимость третьего нуклеотида в кодоне и приводит к тому, что митохондрии требуется меньшее разнообразие типов тРНК. При этом достаточным количеством оказываются всего 22 различных тРНК. Имея собственный генетический аппарат, митохондрия обладает и собственной белоксинтезирующей системой, особенностью которой в клетках животных и грибов являются очень маленькие рибосомы.
48.49. Характеристика реплика́тивного комплекса.Синтез лидирующей и отстающей цепи. Репликация (от лат. replicatio — возобновление) — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15—20 различных белков, называемый реплисомой.ДНК-репликативный комплекс: Субстраты, источники энергии, ферменты, белки. Механизм репликации.
Синтез(репликация, удвоение) днк происходит в S-фазу клеточногна о цикла, когда клетка готовится к делению. Механизм репликации, как установил Мэтью Мезельсон и Франклин Сталь в 1957г. Полуконсервативный, т.е на каждой нити материнской днк синтезируется дочерняя копия.Несколько компонентов:
· Матрица- в ее роли выступает материнская нить днк
· Растущая цепь- дочерняя нить рнк
· Субстраты для синтеза- dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ
· Источники энергии— dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ
Этапы биосинтеза ДНК:
Этап I – инициация биосинтеза ДНК – является началом синтеза дочерних нуклеотидных цепей; в инициации участвует минимум восемь хорошо изученных и разных ферментов и белков.
Этап II – элонгация синтеза ДНК – включает два кажущихся одинаковыми, но резко различающихся по механизму синтеза лидирующей и отстающей цепей на обеих материнских цепях ДНК. Синтез лидирующей цепи начинается с синтеза праймера (при участии праймазы) у точки начала репликации, затем к праймеру присоединяются дезоксирибонуклеотиды под действием ДНК-полимеразы III; далее синтез протекает непрерывно, следуя шагу репликационной вилки.
Этап III – терминация синтеза ДНК – наступает, скорее всего, когда исчерпана ДНК-матрица и трансферазные реакции прекращаются. Точность репликации ДНК чрезвычайно высока, возможна одна ошибка на 10*10 трансферазных реакций, однако подобная ошибка обычно легко исправляется за счет процессов репарации.
Особенности синтеза лидирующей и отстающей цепей
на 3'-5' родительской цепи синтез новой цепи будет идти непрерывно,
эту цепь принято называть лидирующей.
Лидирующая цепь растет в направлении движения вилки,
для ее элонгации необходим лишь один акт инициации.
На другой цепи синтез осуществляется короткими фрагментами, которые называют фрагментами Оказакн по имени исследователя,
впервые их обнаружившего.
Эта цепь называется запаздывающей, или отстающей.
Длина фрагментов Оказаки составляет 1000—2 000 п. н. у прокариот и 100—200 п. н. у эукариот.
Отстающая цепь растет в направлении противоположном движению вилки,
при ее синтезе необходимо множество актов инициации.
53. Экспрессия гена - перенос генетической информации от ДНК через РНК к полипептидам и белкам. Гены, представляющие собой линейные полимеры ДНК, соединены в длинные цепи, которые вместе с белками хроматина образуют хромосомы. В норме все ядерные клетки человека, кроме сперматозоидов и яйцеклеток, содержат 46 хромосом, составляющих 23 пары. В каждой паре одна из хромосом унаследована от одного родителя, а другая - от второго. В большинстве генов человека кодирующая последовательность разделена на сегменты (экзоны), между которыми находятся некодирующие последовательности (интроны). Геном человека состоит из 3 млрд пар нуклеотидов и содержит 50000-100000 генов. Длину участков ДНК обычно выражают в тысячах (или миллионах) нуклеотидов, а также в морганидах. Последний способ основан на анализе сцепления генов: при расстоянии между генами в одну сантиморганиду (0,01 морганиды) вероятность кроссинговера между ними в мейозе равна 1%. В среднем одной сантиморганиде соответствует 1 млн нуклеотидов - то есть геном человека имеет размер приблизительно 3000 сантиморганид. Таким образом, на 1 хромосому приходится в среднем 2000-5000 генов, или 130 млн пар нуклеотидов, или 130 сантиморганид.
Если при дифференциальном окрашивании хромосом на них различимы 800 полос, то каждая полоса в среднем должна содержать 3-5 млн пар нуклеотидов, или 60-120 генов.
Однако такой расчет основан на чрезмерных упрощениях. Оценки общего числа генов весьма приблизительны; хотя в среднем одной сантиморганиде соответствует примерно 1 млн нуклеотидов, это соотношение нарушается для более коротких последовательностей, и, кроме того, оно зависит от пола.
Гены имеют разную длину. Например, длина гена глобина - 1500 нуклеотидов, а гена дистрофина, мутация которого вызывает миопатию Дюшенна, - 2 млн нуклеотидов. Регуляторные цис-элементы (расположенные на одной цепи ДНК с регулируемым геном) иногда удалены от кодирующей области гена на большое расстояние, например цис-элементы гена бета-цепей глобина находятся на расстоянии 50000 нуклеотидов в 5'- направлении и 30000 нуклеотидов в 3'-направлении. Такая организация затрудняет определение границ между генами.
Геном человека содержит и много высокоповторяющихся последовательностей, функция которых пока не известна.
Кроссинговер и сцепление генов можно представить как обмен части тома одного набора на часть соответствующего тома другого набора (1-6 частей на том), так что следующее поколение получает уникальный 23-томный текст, содержащий части обоих исходных наборов.
Сочетание уникальных геномов (наборов), полученных от каждого из родителей, создает генотип, лежащий в основе нашей генетической индивидуальности.
54.55.ОСНОВНЫЕ ОТДЕЛЫ: 1)ПРОКАРИОТ. Общий план строения генов у прокариот и эукариот не отличается – и те, и другие содержат регуляторную область с промотором и оператором, единицу транскрипции с кодирующей и нетранслируемыми последовательностями и терминатор. Однако организация генов у прокариот и эукариот отличается.
В начале и в конце оперона есть единые регуляторные области для нескольких структурных генов. С транскрибируемого участка оперона считывается одна молекула и-РНК, которая содержит несколько кодирующих последовательностей, в каждой из которых есть свой старт- и стоп-кодон. С каждого из таких участков синтезируется один белок. Таким образом, с одной молекулы и-РНК синтезируется несколько молекул белка.
Для прокариот характерно объединение нескольких генов в единую функциональную единицу – оперон. Работу оперона могут регулировать другие гены, которые могут быть заметно удалены от самого оперона – регуляторы. Белок, транслируемый с этого гена называется репрессор. Он связывается с оператором оперона, регулируя экспрессию сразу всех генов, в нем содержащихся.
Для прокариот также характерно явление сопряжения транскрипции и трансляции.
Такое сопряжение не встречается у эукариот из-за наличия у них ядерной оболочки, отделяющей цитоплазму, где происходит трансляция, от генетического материала, на котором происходит транскрипция. У прокариот во время синтеза РНК на матрице ДНК с синтезируемой молекулой РНК может сразу связываться рибосома. Таким образом, трансляция начинается еще до завершения транскрипции. Более того, с одной молекулой РНК может одновременно связываться несколько рибосом, синтезируя сразу несколько молекул одного белка.
2)ЭУКАРИОТ. У бактерий многих видов всего одна хромосома, и почти во всех случаях в каждой хромосоме присутствует по одной копии каждого гена. Лишь немногие гены, например гены рРНК, содержатся в нескольких копиях. Гены и регуляторные последовательности составляют практически весь геном прокариот. Более того, почти каждый ген строго соответствует аминокислотной последовательности (или последовательности РНК), которую он кодирует.
Структурная и функциональная организация генов эукариот гораздо сложнее. Исследование хромосом эукариот, а позднее секвенирование полных последовательностей геномов эукариот принесло много сюрпризов. Многие, если не большинство, генов эукариот обладают интересной особенностью: их нуклеотидные последовательности содержат один или несколько участков ДНК, в которых не кодируется аминокислотная последовательность полипептидного продукта. Такие нетранслируемые вставки нарушают прямое соответствие между нуклеотидной последовательностью гена и аминокислотной последовательностью кодируемого полипептида. Эти нетранслируемые сегменты в составе генов называют интронами, или встроеннымипоследовательностями, а кодирующие сегменты — экзонами. У прокариот лишь немногие гены содержат интроны.
Итак, у эукариот практически не встречается объединение генов в опероны, и кодирующая последовательность гена эукариот чаще всего разделена на транслируемые участки – экзоны, и нетранслируемые участки – интроны.
В большинстве случаев функция интронов не установлена. В целом, лишь около 1,5% ДНК человека являются ≪кодирующими≫, т. е. несут информацию о белках или РНК. Однако с учетом крупных интронов получается, что ДНК человека на 30% состоит из генов. Поскольку гены составляют относительно небольшую долю в геноме человека, значительная часть ДНК остается неучтенной.
56.ПОНЯТИЕ О ГЕНЕ.СТРОЕНИЕ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ И ПРОКАРИОТ. Ген — структурная и функциональная единица наследственности живых организмов. Ген представляет собой последовательность ДНК, задающую последовательность определённого полипептида либо функциональной РНК. Гены (точнее, аллели генов) определяют наследственные признаки организмов, передающиеся от родителей потомству при размножении. При этом некоторые органеллы (митохондрии, пластиды) имеют собственную ДНК, не входящую в геном организма, которая определяет их признаки.Среди некоторых организмов, в основном одноклеточных, встречается горизонтальный перенос генов, не связанный с размножением.Термин «ген» был введён в употребление в 1909 году датским ботаником Вильгельмом Йогансеном.
57.1)КЛАССИФИКАЦИЯ ГЕНОВ. Очевидно, что каждая единица ДНК выполняет какие-то определенные задачи, пусть они пока и неизвестны человечеству. Исходя из этой предпосылки сложилась современная структурно-функциональная классификация генов. Она используется чаще всего, но есть и другие, более узкоспециализированные и учитывающие какие-то конкретные свойства тех или иных участков ДНК. В общем и целом подразумевается такая классификация генов: структурные и регуляторные (функциональные). Каждая из этих разновидностей, в свою очередь, может делиться на группы. Например, среди регуляторов различают модификаторы, супрессоры, ингибиторы и т.д. Также используется деление генов по критерию влияния на жизнеспособность, подразумевающее летальные, полулетальные и нейтральные единицы. 2)КЛАСТЕРНЫЕ ГЕНЫ - результат эволюционного процесса. В некоторых случаях кластеризация генов отражает историю эволюционного развития. Допустим, на ранних этапах эволюции существовал один локус, затем произошла дупликация гена и появилась возможность функционального расхождения. Первая дупликация подготовила почву для последующих дупликаций на основе механизма неравного кроссинговера (разд. 3.5.8) и, следовательно, для дальнейшей функциональной специализации.
58.ПОНЯТИЕ О ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА
Совокупность наследственного материала, заключенного в клетке организма. Геном содержит биологическую информацию, необходимую для построения и поддержания организма. Большинство геномов, в том числе геном человека и геномы всех остальных клеточных форм жизни, построены из ДНК, однако некоторые вирусы имеют геномы из РНК.Существует также и другое определение термина «геном», в котором под геномом понимают совокупность генетического материала гаплоидного набора хромосом данного вида. Когда говорят о размерах геномаэукариот, то подразумевают именно это определение генома, то есть размер эукариотического генома измеряют в парах нуклеотидов ДНК или пикограммах ДНК на гаплоидный геном.У человека (Homo sapiens) наследственный материал соматической клетки представлен 23 парами хромосом (22 пары аутосом и пара половых хромосом), находящихся в ядре, а также клетка обладает множеством копиймитохондриальной ДНК. Двадцать две аутосомы, половые хромосомы Х и Y, митохондриальная ДНК человека содержат вместе примерно 3,1 млрд пар оснований. 2)Митохондрии, которые присутствуют практически во всех эукариот за некоторыми исключениями, играют центральную роль в синтезе АТР и других важных физиологических процессах. Число митохондрий на одну клетку может варьировать от нескольких штук (например, в спермия) до нескольких тысяч (в гепатоцитах). Каждая митохондрия может нести несколько копий ДНК (мтДНК), которые в комплексе с белками образуют структуру, подобную нуклеоид прокариот.
59.ГЕНОМ ПРОКАРИОТ. Основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках (или вирионах - вирусных частицах, в случае вирусов) ядра, отгороженного ядерной мембраной от цитоплазмы, если она существует. В отличие от эукариот, геном прокариот построен очень компактно. Количество некодирующих последовательностей нуклеотидов минимально, интроны редки. У прокариот для кодирования белков часто используются две или все три рамки считывания одной и той же последовательности нуклеотидов гена, что повышает кодирующий потенциал их генома без увеличения его размера.Многие механизмы регуляции экспрессии генов, использующиеся у эукариот, никогда не встречаются у прокариот. Это не относится к вирусам животных и растений, которые, являясь внутриклеточными паразитами эукариотических клеток, используют необходимую часть их генетического потенциала для своих нужд. Простота строения генома прокариот объясняется их упрощенным жизненным циклом, на протяжении которого прокариотические клетки не претерпевают сложных дифференцировок, связанных с глобальным переключением экспрессии одних групп генов на другие, или тонким изменением уровней их экспрессии, что имеет место в онтогенезе эукариот
61.Кариотип - диплоидный набор хромосом, свойственный соматическим клеткам организмов данного вида, являющийся видоспецифическим признаком и характеризующийся определённым числом, строением и генетическим составом хромосом. Индивидуальные хромосомы, которые составляют 23 пары сильно различаются по размерам и расположению центормеры. Хромосомы окрашиваются специальным красителями для определения разницы в их составе.Являясь видовой характеристикой организмов, кариотип может отличатся у отдельных организмов. Например, у представителей разного пола. Каждый вид хромосом в кариотипе, содержит определенный комплекс генов, представлен двумя гомологами.
Идиограмма это систематизированный кариотип в котором хромосомы располагаются по мере уменьшения их размеров. Точно расположить хромосомы по размеру удается далеко не всегда, так как некоторые пары имеют близкие размеры. Поэтому в 1960 г была предложена Денверская классификация хромосом, которая помимо их размеров учитывает форму, положение центромеры, наличие вторичных перетяжек и спутников. Согласно этой классификации, 23 пары хромосом человека разбили на 7 от А до G. Важным признаком, облегчающим классификацию, является центромерный индекс, который отражает отношение (в процентах) длины короткого плеча к длине всей хромосомы.
62. Денверская классификация хромосом человека. Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека впервые были приняты на международном совещании в 1960 году в г. Денвере. Согласно Денверовской классификации все хромосомы человека разделены на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины и с учетом центриольного индекса (отношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы, выраженное в процентах).
63. Методы анализа ДНК. Молекулярно-генетические методы исследования. Выделение ДНК. ПЦР. ДНК-микрочип. 64. Методы ДНК анализа. Основные этапы анализа. 65. Методы секвенирования генов в диагностике наследственной болезни. Молекулярно-генетические методы - большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций (повреждений) в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК.
Выделение геномной ДНК
1) Лизис клеток и клеточных мембран.
Клетки разрушают механически или с помощью ферментативной обработки.
2) Удаление белков (депротеинизация).
Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта.
3) Получение концентрированной фракции нуклеиновых кислот
ПЦР полимеразная цепная реакция - реакция, позволяющая быстро получить большое количество копий конкретного фрагмента ДНК
Преимущества ПЦР: 1) Высокая чувствительность 2) Высокая специфичность 3) Простота в исполнении 4) Скорость
Компоненты реакции: 1) Праймеры 2) ДНК – полимераза 3) Смесь нуклеотидов (дезоксинуклеотидтрифосфатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ) 4) Буферный раствор (вода и соли) 5) Анализируемый образец (ДНК)
Принципы ПЦР:
1) Использование термостабильной полимеразы (Taq - полимераза)
2) Полимераза достраивает специфические затравки (праймеры)
3) Амплификацию проводят в течение 30-40 циклов
4) Каждый цикл состоит из смены температурных режимов
5) За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в более чем 1млрд раз
Этапы одного цикла ПЦР:
1) Денатурация (95°C) - разделение двух цепей ДНК друг от друга
2) Гибридизация (отжиг) - присоединение праймеров к комплементарным участкам на матрице (45-65°C) Формируются структуры узнаваемые ДНК-полимеразой
3) Синтез (элонгация) цепи (72°C) -синтез комплементарных цепей - удваивается фрагмент ДНК
ДНК - микрочип - миниатюрная пластина с нанесенными на нее в определенном порядке фрагментами ДНК известной последовательности для проведения генетического анализа. ДНК-микрочип - устройство, созданное по аналогии с электронными микросхемами (чипами), предназначенное для одновременного выявления множества определенных последовательностей ДНК. ДНК - микрочип используется для изучения экспрессии генов и поиска мутаций в биомедицинских исследованиях.
Методы ДНК-анализа Люди я хз следующее это методы ДНК анализа или все таки его этапы
Основные этапы молекулярно-генетические методов:
1.Получение образцов ДНК.Включает в себя выделение всей ДНК из клеток или накопление определенных фрагментов. Источником reномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Для этoro используют каплю крови, лейкоциты, культуры фибробластов, соскоб эпителия со слизистой оболочки, волосяные луковицы.
2.Амплификация (получение большого количества копий) фрагментов ДНК - с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция). ПЦР проводится с использованием специального прибора – ДНК-амплификатора (ПЦР - машины) в лабораторных условиях. Для
амплификации исходно требуется незначительное количество биоматериала. Для проведения ПЦР нужно знать нуклеотидную последовательность амплифицируемого фрагмента.
3.Рестрикция (разрезание) ДНК на фрагменты, необходимый этап молекулярно - генетической диагностики, осуществляется ферментами - бактериальными эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами). Используется несколько десятков рестриктаз. Они способны разрезать двух цепочечную ДНК в строго определенных местах.
4.Электрофорез фраментов ДНК - разделение фрагментов ДНК в агарозном геле.Электрофорез ДНК проводится с использованием специального прибора - электрофоретической камеры. Камера имеет электроды с разными полюсами, заполняется агарозным гелем и в гель, в области отрицательного электрода вносятся образцы содержащие фрагменты ДНК. Под действием постоянного электрического поля происходит разделение фрагментов ДНК (движутся от отрицательного полюса к положительному) в зависимости от их размеров и молекулярной массы. Электрофорез ДНК используется при различных методах молекулярно - генетической диагностики.
5.Секвенирование ДНК - определение нуклеотидной последовательности фрагмента или целой молекулы ДНК. Секвенирование ДНК - наиболее затратный метод исследования ДНК, проводится с использованием специального прибора - генетического анализатора (секвенатора).
Вот эти вроде методы (+ ПЦР, который описан выше):
1) Детекция электрофорезом - разделение фрагментов ДНК (ампликонов) в геле в соответствии с их зарядом и линейными размерами. Флюоресцентная детекция (использование интеркаляторов)
Метод «FLASH » - специфическая rибридизация в процессе амплификации е меченными ДНК - зондами. Флюоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК.
В основе ПЦР в реальном времени (RT PCR) так же лежит принцип фруоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации.
Применение в современной медицине и науке:
* Гeнотипирование организмов
* Диагностика инфекционных заболеваний
* Диагностика rенетических заболеваний и генетической предрасположенности.
* Установление родства,
* Идентификация личности.
* Анализ древних останков,
* Криминалистика
* Определение ГМО
2)Секвенирование последний этап молекулярного анализа предварительно отобранноro, клонированного и протестированного более простыми методами фрагмента ДНК. Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК путем получения серии комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание.
Метод Сэнгера метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи.
Для проведения секвенирования необходимы:
* секвенирующий праймер (искусственно синтезированная олигонуклеотидная последовательность, комплементарная определенному участку исходной молекулы ДНК)
* четыре пробирки с набором из четырех дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых изотопно меченный соответственно добавляемому одному из четырех дилезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP)
* ДНК- полимераза.
Метод включает следующие этапы:
1) Гибрилизацию изучаемого фрагмента ДНК с праймером
2) Ферментативный синтез ДНК
3) Денатурашно полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олиг ° нуклеотидные последовательности, содержащие праймер)
4) Электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов)
5) Анализ результатов на радиоавтографе.
При помощи секвенирования по размеру синтезированных фрагментов может быть определена локализация дилезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК.
3)Рестриктационный анализ - установление мест расщепления одной или несколькими рестриктазами конкретной нуклеотидной последовательности ДНК.
Метод ПДРФ – метод основанный на ПДРФ (полиморфизме длин рестриктационных фрагментов – участки ДНК разной длины после обработки ДНК определенной рестриктазой) ДНК, который используется для идентификации и клонирования генов, а также для построения генетических карт.
4)Гибридизация Саузерн-блот гибридизация – специфические фрагменты ДНК выявляют путем блот-гибридизации по Саузерну.
5)Анализ с помощью ДНК-микрочипа
66. Библиотека генов. Клонотека. Библиотека генов(Клонотека) - полный набор генов данного организма, полученный в составе рекомбинантных ДНК
SCOPUS - охватывает примерно 14 тыс. названий журналов по различным областям науки и техники (более 4 тыс. международных издательств). Список журналов - в открытом доступе, пополняется два раза в год. включаются журналы из разных регионов мира, в том числе неанглоязычные журналы (но с англоязычными рефератами). Содержит информацио по биологии, медицине, фармакологи сельскому хозяйству, наукам об окружаошей среде. Самый, по всей видимости обширный сайт по биоинформатике принадлежит Национальному центру биотехнологической информации (NCBI) Национального института здоровья США (NIH).Общедоступные базы данных сайта NCBI включают GenBank(база данных, содержащая все аннотипированные последовательности ДНК и РНК, а также последовательности закодированных в них белков.), формируемый NCBL базы данных OMIM (Менделирующая последовательность человека OMIM - каталог наследственных болезней), dbEST (Database of Expressed Sequence Tags - ДНК - копий информационной РНК), dbSTS (Database of Sequence Tagged Sites – коротких фрагментов ДНК), и SNP (Single Nucleotide Polimorphism - однонуклеотидных замен или полиморфизмов). MEDLINE – крупнейшая библиографическая база статей по медицинским наукам PubMed – бесплатная версия базы данных MEDLINE
67. Методы генной инженерии в медицине. Генетическая инженерия - совокупность методов и технологий получения рекомбинантной ДНК, выделения reнов из организма (клеток). осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью rенетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы opraнизму свойства, полезные для человека. Например, получение микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками.Методы генной инженерии позволяют провести rенетическую паспортизацию, диагностировать reнетические заболевания, создават днк-вакцины, проводить reнотepaпию различных заболеваний.Методы генной инженерии состоят из основных этапов:
1. Получение изолированного гена
2. Введение этого гена в векторную молекулу и создание рекомбинантной молекулы ДНК для переноса в opraнизм
3. Перенос вектора с reном в модифицируе