различных видов животных

Определение перекрестной реактивности белков

(двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони)

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

1. Определить родство некоторых белков у различных животных.

2. Ознакомится с оборудованием и методикой двойной радиальной им­мунодиффузии.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от дру­га вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соот­ветствующими растворами. Антигены и антитела диффундируют в гель и в зоне эквивалентности формируют иммунные комплексы, которые образуют в порах геля преципитат в форме линий. Иммунологическое сродство можно определять, проводя реакцию преци­питации в соседних лунках. Образованные каждым из антигенов линии мо­гут либо полностью сливаться - это указывает на их иммунологическую идентичность, либо сливаться частично и образовывать "шпору" - это свидетельствует о частичном родстве антигенов, либо в случае неродс­твенных антигенов пересекаться. Следует подчеркнуть, что даже полностью сливающиеся линии свиде­тельствуют лишь об иммунологической идентичности, причем только для данной антисыворотки, а вовсе не об идентичности самих молекул антиге­нов.

НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫИ ОБОРУДОВАНИЕ.

Предметное стекло (3 шт.), горизонтальный столик, 1,5%-ная агароза (3 пробирки по 5 мл), пробойник «семёрка», игла, сыворотки крови различных животных, донорская плазма, моноспецифическая антисыворотка против IgG, IgA и IgM, фильтровальная бумага, влажная камера, автоматические пипетки, носики.

ХОД РАБОТЫ.

1. Предметное стекло, предварительно намазанное 1%-ной агарозой, кладут на строго горизонтальный столик и затем заливают расплавленным гелем 1,5%-ной ага­розы (5 мл на стекло). Как только агароза затвердеет, пластинки готовы к использованию.

2. После застывания геля специальным пробойником «семёрка» вырезают лунки в форме ромашки. Удаляют гель из лунок иглой.

3. Заливают в соответствующие лун­ки антисыворотку и антиген по 15 мкл, как показано на рисунке.

о-1 В лунки 1, 3, 5 - заливают

о-6 о-2 донорскую плазму.

о-7 В лунку 7 - моноспецифическую анти-

о-5 о-3 сыворотку.

о-4 В остальные лунки сыворотки крови

различных животных.

Затем стекло оставляют на иммунодиффузию во влажной камере на 24-48 часов. После иммунодиффузии регистрируют результаты.

ПРИМЕЧАНИЯ.

1. Приготовление забуференного физиологического раствора.

1.1. Готовят 0,15 моль/л фосфатный буферный раствор, рН 7,2:

А. 0,907 г КН₂PО₄ растворяют в 100 мл Н₂Одист

Б. 1,187 г Na₂НРО₄*2Н₂О растворяют в 100 мл Н₂Одист.

К 59,2 мл раствора А прибавляют раствор Б, контролируя рН (дово­дят объем приблизительно до 200 мл).

1.2. Готовят забуференный физиологический раствор с 0,02% NaN₃.

К 180 мл 0,15 моль/л раствора натрия хлорида добавляют 20 мл 0,15 моль/л фосфатного буферного раствора (рН 7,2), при перемешивании раст­воряют 40 мг азида натрия.

2.Приготовление 1.5 %-ного геля агарозы.

4 г ПЭГа растворяют в 200 мл забуференного физиологического раствора, после растворения ПЭГа тонкой струйкой при постоянном перемешивании добавляют 3 г агара (агарозы). Расплавленный агар (агарозу) равномерно разливают в пробирки по 5 мл. Пробирки хранят в холодильнике при 2 - 8⁰С, срок хранения 8-12 месяцев.

3. Обработка стекол.

Стеклянные пластины 84*94 мм и предметные стекла моют хромовой смесью, ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой. Вы­держивают в сушильном шкафу при температуре 160 – 200⁰С. Остывшее стекло покрывают тонкой пленкой геля: приблизительно 1 мл расплавлен­ной 1%-ой агарозы размазывают тампоном по поверхности стекла, можно также использовать технику "гематологического мазка" - проводят другой стек­лянной пластинкой, наклоненной под углом 45⁰. Пластины помещают на 15-20 минут в термостат при температуре 60^оС. Обработанные таким обра­зом пластины помечают на обратной стороне знаком ”Х” для отметки, что покрытие проведено (т.к. пленка невидима). Обработанные пластины прок­ладывают (фильтровальной) бумагой и хранят при комнатной температуре в течение 1-2 месяца.

ВОПРОСЫДЛЯ ПОДГОТОВКИ.

1. Какие функции выполняет гель в иммунодиффузионных методах?

2. Какова чувствительность ДИД?

3. Что такое шпора и когда она образуется?

4. Что такое титр, чувствительность антисыворотки?

5. Что такое аффинность?

6. Дать определения понятиям: антиген, антитело, антисыворотка.

7. Какие ещё существуют методы иммунодиффузии?

ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ.

1. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М:Мед. - 1987 г. - С. 73 - 88.

2. Иммунохимия в клинической и лабораторной практике / Под ред. А.М. Уорда, Дж. Т. Уичера. - М: Медицина. - 1981 г. - С. 25 - 31.

3. Антитела. Методы / Под ред. Кетти Т. - 1 том. - М: Мир. - 1991 г. - С. 201 - 207.

4. Иммунология. Практикум / Е.У. Пастер, В.В. Овод, В.К. Позур, Н.Е. Вихоть. - К: Выща шк. - 1989 г. - С. 5 - 57.

5. А. Ройт. Основы иммунологии. - М: Мир. - 1991 г. - С. 85 - 86.

6. Иммунология / Под ред. У. Пола. - 3 том. - М: Мир. - 1989 г. - С. 72- 73.