Как уже упоминалось, процесс эндоцитоза начинается на плазматической мембране, осуществляющей барьерно-контактные функции между окружением и внутренней средой клетки. Для формирования инвагинации необходимо ремоделировать слой кортикального актина. Кортикальный актин может участвовать в формировании инвагинаций, отрыве пузырька от мембраны и начальной стадии транспортировки с помощью «кометы» до взаимодействия с МТ. Существуют множественные взаимодействия между белками, регулирующими эндоцитоз, и белками, участвующими в ремоделировании актиновых филаментов. И, тем не менее, результаты экспериментов по изучению влияния разборки МФ на интернализацию достаточно противоречивы, что позволяет называть роль актина «различной, но необязательной» (S.Schmid). Возможно, этот парадокс связан с трудностями анализа чрезвычайно лабильных процессов с применением методик, использующих фиксацию клеток, например, электронной микроскопии, единственного на настоящий момент подхода, позволяющего разрешать цитоскелетные и мембранные структуры на необходимом высоком уровне.
Однако существуют процессы интернализации, в которых роль актиновых МФ несомненна. Так, при разрушении МФ полностью блокируется фагоцитоз, поскольку формирование протрузий мембраны, с помощью которых клетка обволакивает крупную частицу или бактерию, регулируется совместно PIP3, продуктом PI-3-киназы, и актиновым мотором миозином-Х. Предполагается, что кластеризация Fcγ рецепторов, узнающих бактериальную мембрану, в сайте ее прикрепления к макрофагу, является триггером сигнальных событий, приводящих к сборке пучков актина и появлению PIP3 именно в этих участках клеточной мембраны. Миозин-Х, обладающий РН-доменом, заякоривается на этом фосфолипиде, а своей головной «моторной» частью связывается с актином и движется к растущему концу микрофиламента, упирающемуся в мембрану. Развиваемые при этом двойном взаимодействии силы способствуют выпячиванию псевдоподий вокруг бактерии. Мембраны, необходимые для роста псевдоподии, включаются в ее основание за счет встраивания рециклирующих эндосом, опосредуемого SNARE Vamp3. Далее концы псевдоподий смыкаются, и образуется фагосома.
Сформированная эндосома или фагосома затем заякоривается на плюс-конце микротрубочки, которая находит везикулу в процессе «сканирования» примембранного пространства в ходе серии циклов роста/укорочения плюс-конца. Белки, кэпирующие плюс-конец МТ, захватывают эндосомы и передают ее на динеин-динактиновый комплекс, который в дальнейшем и осуществляет движение эндосомы к минус-концу МТ.
То, что эндоцитозный путь (от периферии в околоядерную зону) опосредуется микротрубочками, не подлежит сомнению, но значение связи с МТ для транспорта различных грузов отличается. Предполагается, что одним из первых событий, для которых нужны МТ, является сортировка грузов для вступления на путь деградации. Рассматривается схема, в соответствии с которой тело ранней эндосомы заякоривается на МТ с помощью белков скэффолда, тогда как моторные белки благодаря опосредованному взаимодействию с сортируемыми рецепторами прикрепляются к той части эндосомы, из которой впоследствии будет формироваться МВТ, и за счет развиваемых моторами сил эта часть отрывается от ранней эндосомы.
Из этой схемы следует, что сортировка рецепторов должна существенно зависеть от наличия интактных МТ. Однако в общем случае сортировка жидкофазных маркеров из РЭ в ПЭ и эффективность их деградации в значительно большей степени зависят от МТ, чем трансмембранные белки (например, рецепторы ЭФР). Возможно, дело в том, что растворимый груз упакован в везикулы, мембрана которой достаточно «пассивна» с точки зрения возможности влияния на собственную судьбу, и в этом смысле в случае пиноцитоза работают универсальные базовые механизмы. В случае же рецептор-опосредованного эндоцитоза регуляторная (а в случае тирозинкиназных рецепторов и каталитическая) часть рецептора экспонирована в цитоплазму и участвует во множестве специфических взаимодействий. Это создает широкие возможности регуляции, среди которых связь с МТ может быть не самой важной. Можно предполагать, что такие рецептор-содержащие эндосомы сами могут влиять на систему МТ. В ряде работ доказывалось, что созревание МВТ (оцениваемое по увеличению числа внутренних пузырьков) не зависит от МТ, но им противоречили исследования, показывающие, что в отсутствии МТ эндосомы не увеличиваются (а это является предпосылкой для формирования МВТ), либо этот процесс чрезвычайно замедлен, и деградация рецепторов-грузов также подавляется. Противоречие это не разрешено, но появляются данные, свидетельствующие о том, что ранние эндосомы перемещаются по динамичным, относительно прямым микротрубочкам, тогда как поздние укрупненные эндосомы с мультивезикулярной морфологией локализованы в околоядерной области на сильно искривленных, спутанных высокоацетилированных (а значит, стабильных) МТ. Вопрос регуляции перехода от динамичных к стабильным МТ остается открытым. Есть данные о возможном взаимодействии белка TSG101, компонента сортирующего ESCRTI-комплекса с МТ-повреждающим белком статмином. Также сообщалось, что деацетилаза HDAC6, связанная с динамичными МТ, блокируется через 30 мин после стимуляции эндоцитоза рецептора ЭФР, после чего ацетилирование микротрубочек возрастает. В качестве рабочей гипотезы можно рассматривать предположение о том, что на определенной стадии эндоцитоза ассоциация статмина с эндосомой в непосредственной близости от МТ может приводить к разборке последней. При этом HDAC6 переходит в цитоплазму и деактивируется, а восстановленные затем МТ оказываются уже стабильными. Пример регуляции активности МТ-ассоциированного белка в результате деполи-меризации МТ представляет собой механизм активации GEF H1- активирующего фактора малой ГТФазы Rho: при разборке МТ он активируется и стимулирует Rho-опосредованную сборку стресс-фибрилл.
Зачем может быть нужна стабильность МТ на поздних стадиях эндоцитоза? Во-первых, густая сеть сильно искривленных МТ существенно повышает вероятность встречи (а следовательно, и слияния) двух или более поздних эндосом друг с другом, несмотря на то, что перемещаются они по МТ в одном направлении с помощью одних и тех моторов-динеинов. С другой стороны, повышается вероятность их встречи с первичными лизосомами, контакт с которыми происходит по механизму “kiss-and-run”. После образования гибридной органеллы необходимо некоторое время для нормального протекания процессов гидролиза, и постоянно растущие или деполимеризующиеся МТ могут сильно затруднить его. Эта гипотеза еще нуждается в дополнительном подтверждении.
Известно, что разрушение актина приводит к формированию увеличенных эндолизосом, тогда как разборка микротрубочек на этой стадии вообще подавляет слияния поздних эндосом с лизосомами. На этом последнем этапе мы опять видим, как актиновые филаменты и МТ работают совместно, но роль МФ реализуется локально, в околоядерной области.
Строго говоря, в вопросе о роли цитоскелета в направленном перемещении везикул есть много парадоксального. Действительно, то, что везикулы используют МТ для «поездок» и обладают всеми средствами для этого, факт несомненный. Однако различная степень зависимости конкретных этапов транспортных путей от МТ должна вносить очень большую неопределенность в процессы, по-видимому, очень жестко регулируемые. Еще больше вопросов возникло при анализе данных, полученных с помощью видеофильмов. Так, наблюдения за треками нескольких секреторных везикул, содержащих флуоресцентно-меченый груз, показали, что строго направленного, упорядоченного движения практически не существует. Это в полной мере справедливо и для эндосом. Частица может долго «топтаться на месте», а затем быстро переместиться на расстояние в несколько микронов. Более того, через некоторое время та же частица может резко изменить направление движения на прямо противоположное или направленное под любым другим углом. Складывается впечатление, что везикулы ведут себя как мальчишки, в не столь давние времена развлекавшиеся катанием на «колбасе» трамвая: им все равно, какой у трамвая номер и куда он направляется, весь смысл в том, чтобы накататься вдоволь. Таких «отчаянных» не так уж и много: наблюдая в живых клетках за флуоресцентно-мечеными эндо- или экзосомами, видно, что из нескольких десятков везикул в поле зрения за времена порядка нескольких минут совершают протяженные прямые марш-броски лишь единичные везикулы. Возможность разнонаправленного движения подкрепляется данными о том, что одна и та же везикула может нести как плюс-, так и минус-моторы. На первый взгляд, такая организация транспорта в клетке кажется нерациональной. Можно было бы думать, что мечение и процесс наблюдения вносят очень большие возмущения в работу всей системы. Однако, учитывая реальные времена, в течение которых, например, эндосомы перемещаются от периферии в околоядерную область (а это в среднем от 15 до 60 мин при расстоянии в 10–20 мкм и скорости моторных белков, оцениваемой в 20 мкм/мин и выше) понятно, что «трамвайная» модель близка к истине. С другой стороны, следует учитывать, что (1) везикулы в итоге достигают пункта своего конечного назначения, а (2) остановки в пути, возможно, требуются для каких-то процессов, например, связанных со слиянием/созреванием везикул или с сигнализацией. Изменение направления движения или остановка могут отражать не просто перескок с одной МТ на другую соседнюю, а, например, деполимеризацию МТ, с которой везикула была связана, ее пострансляционную модификацию, делающую движение неэффективным, и т. д. Необходимо заметить, что в ситуациях, когда движение по МТ обязательно для жизнедеятельности клетки (например, при перемещении сигнальных эндосом по аксонам нервных клеток, или при обеспечении или регуляции пигментации), оно осуществляется гораздо более упорядоченно, а нарушения в системе регуляции МТ-зависимого транспорта приводят к серьезным патологиям.