Интересным примером взаимодействия тубулиновых и актиновых цитоскелетных структур является транспорт меланосом в системе «меланоцит-кератиноциты» (рис. 39).
 |
Рис. 39. Меланосомы, созревая, меняют Rab-белки и моторы
Меланоциты – клетки с дендритоподобной морфологией, способные синтезировать пигмент меланин. Как любой вновь синтезированный белок, на выходе из транс-Гольжди он упаковывается в везикулы-меланосомы, которые с помощью Rab7 и динеина перемещаются по МТ к ЦОМТ, т. е. проходят часть эндоцитозного пути. Здесь, где плотность МТ велика, меланосому (достигшую определенной степени зрелости) перехватывает Rab27a, способный ассоциироваться с кинезином. За счет этого взаимодействия меланосома начинает двигаться от ядра по дендриту. На определенном этапе, коррелирующем со степенью зрелости меланосомы, к ней рекрутируется белок меланофиллин, связывающийся с актиновым мотором миозиномVa. Меланосома в результате покидает микротрубочку и переходит на актиновые филаменты, подстилающие мембрану дендрита и движется по ним к окончанию дендрита, также называемого синапсом. Одна клетка-меланоцит существует в окружении многих кератиноцитов. Через синапсы она передает меланосомы с помощью неясного пока механизма в кератиноцит, где они выстраиваются над ядром, обеспечивая пигментацию кожи и защиту генетической информации в ядре от избыточного ультрафиолетового облучения. Одна из причин всем известного альбинизма связана с дефектами транспортной системы меланоцита, в результате которых он оказывается неспособным доставлять меланосомы к синапсам, накапливая их в теле меланоцита (рис. 40).
У животных, способных к мимикрии, например, у рыб, меланосомы в меланоцитах (меланофорах) могут переходить от агрегированного состояния к дисперсному распределению за счет координированного движения по МТ. Равномерность распределения меланосом по клетке в этом случае поддерживается дополнительными перемещениями по коротким актиновым филаментам, ориентированным преимущественно перпендикулярно радиальным микротрубочкам.
 |
Рис. 40. Нарушения транспорта меланосом в меланоцитах
приводит к накоплению в них пигмента и его
недостаточности в кератиноцитах
10. ВЕЗИКУЛЯРНЫЙ ТРАНСПОРТ
В МИТОЗНЫХ КЛЕТКАХ
До сих пор мы говорили о регуляции везикулярного транспорта в интерфазных клетках. А что происходит при прохождении клеткой митоза – жизненно важного процесса, связанного с полной реорганизацией цитоскелета, особенно тубулинового, и необходимостью делить пополам органеллы, имеющиеся в одном экземпляре (ЭПР, АГ)?
Общая картина такова: везикулярный транспорт блокируется. Так, эндоцитоз прекращается за счет подавления интернализации и блокировки слияния ранних эндоцитозных пузырьков циклозависимой киназой Сdc2.
Околоядерная область ЭПР (непосредственно переходящая в ядерную мембрану) частично фрагментируется, в результате разбирается ядерная оболочка. При этом основная периферическая тубулярная сеть остается интактной.
Вопрос о том, «куда уходит Гольджи» в митозе, тесно связан с проблемой его наследования при делении. Установлено, что 20 % мембран АГ остаются интактными. Судьба же основной массы АГ была предметом длительных дискуссий. Так, было показано, что аппарат Гольджи фрагментируется так же, как и при обработке нокодазолом, поскольку интерфазные МТ деполимеризуются. Эта фрагментация происходит по механизму СOPI-зависимой везикуляции, а обратному слиянию фрагментов препятствует циклозависимое фосфорилирование белка дистанционного взаимодействия GM130. Долго считалось, что фрагменты распределяются случайным образом между дочерними клетками и затем сливаются вновь по завершении формирования новой мембраны между клетками.
Последние работы позволяют предполагать, что мембраны Гольджи в митозе уходят в ЭПР и смешиваются там с резидентными липидами и белками ЭПР (BFA-подобный эффект), не образуя никаких сегрегированных субдоменов; после митоза идет восстановление аппарата Гольджи за счет COPII-зависимого транспорта (действительно, в клетках, дефектных по Sar1p, АГ после митоза не восстанавливаются полностью). Уход в ЭПР не полный – остаются те самые 20 % фрагментов, работающих как «затравка» при восстановлении транспорта из ER после окончания митоза.
11. РЕГУЛЯЦИЯ ЭНДОЦИТОЗА РЕЦЕПТОРОВ
ЭФР КАК ПРИМЕР ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТРАНСПОРТНОЙ МАШИНЕРИИ
Эндоцитоз рецепторов ЭФР является исключительно удобной моделью для того, чтобы продемонстрировать, как работают те различные механизмы формирования, слияния, созревания и перемещения везикул, о регуляции которых в отдельности говорилось в предыдущих главах. Судьба этих широко экспрессируемых рецепторов изучена достаточно полно, хотя и сейчас открытых вопросов остается больше, чем решенных.
Этот пример хорош также тем, что ЭФР и его рецептор – это сигнальная система, сопрягающая внешнюю среду и внутриклеточные процессы, и его можно использовать для понимания роли транспорта во внутриклеточной сигнализации, чему будет посвящена следующая глава. Для целостности изложения некоторые моменты, описанные ранее, будут повторены. Надо также принять во внимание, что последовательность описываемых событий может несколько отличаться от реальной, поскольку многие процессы происходят одновременно, а координация других еще неизвестна.
Итак, основным путем входа ЭФР-рецепторных комплексов в клетку является клатрин-зависимый путь. Считается, что спусковым механизмом интернализации рецептора ЭФР является формирование его комплекса с лигандом, т. е. ростовым фактором, – событие, необходимое для стимуляции тирозинкиназы (ТК) рецептора (рис. 39). Однако можно считать установленным, что для интернализации важна не столько активация ТК, сколько димеризация рецепторов. Во-первых, именно димеризация, активируемая связыванием с лигандом, приводит к стимуляции ТК партнера по «кросс-механизму». Во-вторых, даже в отсутствие лиганда димеризация в результате экспозиции доменов димеризации, или “dimerization arms” (например, при действии некоторых ингибиторов ТК рецептора, например, тирфостина AG1478, который связывается с активным центром фермента), рецептор интернализуется. Однако, ряд данных говорит о том, что рекрутирование рецептора в окаймленные клатрином ямки зависит от фосфорилирования им по тирозину белков Eps15/epsin, и убиквитинирования рецептора убиквитин-лигазой с-Cbl, что несомненно требует рецепторной ТК активности. Противоречие это до сих пор не разрешено, хотя факт интернализации димеров неактивированных рецепторов надежно установлен.
Рис. 41. Формирование димеров рецептора ЭФР
при связывании с лигандом (ЭФР) приводит к активации т
ирозинкиназы домена и фосфорилированию ряда тирозиновых
остатков в С-терминальном домене рецептора. Эти
фосфотирозины узнаются партнерами рецептора и свзязываются
с ним. В результате запускаются сигнальные каскады,
и стимулируется эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов.
Тем не менее, в норме активация ТК рецептора является необходимым условием для ряда последующих стадий. На рис. 42 представлена общая схема эндоцитоза рецептора ЭФР. Принцип организации эндоцитозного пути состоит в том, что груз «нанимает» менеджера, который профессионально занимается рекрутированием «сотрудников» для выполнения определенных операций. В этом смысле можно говорить о том, что груз сам управляет своей судьбой. В качестве менеджера выступает, как нетрудно догадаться, один из Rab-белков, а именно Rab5: активированный рецептор стимулирует эффектор RIN1, работающий как GEF для Rab5.
 |
Рис. 42. Общая схема эндоцитоза рецептора ЭФР
Интересно, что и завершение работы Rab5 на поздних этапах эндоцитоза происходит, когда рецептор ЭФР стимулирует посредством фосфорилирования по тирозину фактор RN-tre, служащий GAP для Rab5 (рис. 43).
 |
Рис. 43. Рецептор ЭФР сам «организует» свой эндоцитозный
путь с помощью регуляции активности малой ГТФазы Rab5
Все последующие события определяют два фактора: активация Rab5 и убиквитинирование рецептора по нескольким лизинам в ТК- ГТФ-Rab5 рекрутирует на мембрану эндосомы ряд белков, которые поддерживают его в активном состоянии уже без участия RIN1 (GEF Rabex5), и через 1–5 мин – вспомогательную субъединицу р150 PI3-киназы Vps34, к которой затем присоединяется сама киназа и создает на мембране эндосомы домен, обогащенный PI-3-монофосфатом (рис. 44, 45). Рекрутируются также рабаптины 5 и 4, формирующие области, стабилизирующие локализацию Rab5 и Rab4, очерчивая тем самым платформы, на основе которых будут формироваться поздние и рециклирующие эндосомы. Кроме того, к PI3P-обогащенным участкам благодаря наличию FYVE-домена рекрутируется фактор дистанционного взаимодействия (tether) EEA1, димер которого может раскрываться наподобие ножниц, один конец которых содержит FYVE-домены, а другой ― Rab5-связывающий RBD домен. ЕЕА1 ― ключевой белок первой фазы гомотипического слияния эндосом, необходимого для увеличения площади их мембраны. Фактор ЕЕА1 локализуется на везикулах неясной пока этиологии, и при стимуляции эндоцитоза эти везикулы взаимодействуют с вновь образовавшимися эндосомами, формируя своего рода гибридные эндосомы. Такие эндосомы способны поддерживать несколько циклов слияния
По некоторым данным, ЕЕА1, Rabaptin5 и Rabex5 формируют на мембране олигомерный комплекс, содержащий также NSF. В мембране эндосом присутствует t-SNARE синтаксин-13 (syn13), который временно включается в этот комплекс за счет прямого взаимодействия с ЕЕА1. Показано также наличие syn6 и v-SNARE Vamp8. EEA1 способен связывать кальмодулин. Вся эта машинерия обеспечивает Са2+ -зависимое гомотипическое слияние. Затем происходит сегрегация мембран ЕЕА1-позитивной везикулы и рецептор-содержащей эндосомы, которая в результате увеличивается в размерах со 100 нм в диаметре до 600–800 нм. Для процесса сегрегации важно наличие интактных микротрубочек.
Интернализованный рецептор может вступить и на путь рециклирования. Это происходит как в случае потери рецептором фосфорилирования по тирозину 1045, сайту связывания с-Сbl, например, в результате активности фосфатаз, так и с активным рецептором, если количество интернализованных молекул слишком велико (по весьма приблизительным оценкам, больше 20 тыс. на клетку). Кроме того, эндоцитоз, стимулируемый другими лигандами рецептора, например, TGFα, заканчивается рециклированием, поскольку при уровнях рН в эндосомах около 6,5–6,7 этот лиганд диссоциирует из комплекса, и ТК рецептора деактивируется.
Факторы, обеспечивающие насыщение пути сортировки в поздние эндосомы, до сих пор неизвестны, однако феномен этот проявляется при концентрациях ЭФР, на один-два порядка превышающий физиологические уровни ростового фактора в плазме крови, достигающие обычно 10-14–10-12 Моль.
Данных о машинерии, вовлеченной в формирование рециклирующих эндосом, немного. Так, известно, что рециклирование рецептора через околоядерный рециклирующий компартмент опосредуется Rab11 и укороченной формой белка Eps15 – Eps15S. Возвратный путь из эндосом в транс-сеть АГ зависит от Rab9 и белкового комплекса, называемого Retromer. Механизм формирования «короткого» пути рециклирования эндосом, управляемого Rab4, известен плохо.
По всей видимости, домены, ответственные за слияния (ЕЕА1-позитивные) и ответственные за сортировку груза и формирование поздней эндосомы (рецептор-позитивные), простанствено разделены, хотя функционирование обоих связано с наличием активного Rab5 и PI3P. ЕЕА1-везикулы сливаются с ранней эндосомой через 1–5 мин после стимуляции интернализации, и диссоциирует с ними через 30–60 мин. Параллельно со слияниями протекает процесс сортировки груза, в данном случае рецептора. Именно тут совместно работают PI3P и убиквитинирование (рис. 44).
Рис. 44. Ключевые начальные события, обеспечивающие
вступление рецептора на путь лизосомной деградации ―
его убиквитинирование и рекрутирование
на мембрану PI3-киназы Vps34
Суть сортировки (рис. 45) состоит в том, что рецептор передается с рук на руки четырем сортирующим комплексам, ESCRT0-III. ESCRT0 состоит из белка HRS, STAM (Src homology 3 (SH3) domain of signal transducing adapter molecule) и сортирующего нексина SNX1. HRS имеет FYVE-домен и за счет этого ассоциирован с мембраной, и убиквитин-связывающий домен, позволяющий ему взаимодействовать с убиквитинированным рецептором. SNX1 является клатрин-связывающим белком, и, таким образом, в зоне сортировки рецепторов создается плоская клатриновая решетка, предоставляющая широкие возможности для рекрутирования и других белков.
 |
Рис. 45. Сортировка рецептора на путь деградации
осуществляется ESCRT-комплеками. ТК рецептора необходима
для постоянной активации с-Cbl, поддерживающей рецептор в убиквитинированном состоянии, несмотря на присутствие деубиквитинироующих ферментов
Интересно, что SNХ1 связывается с HRS через тот же домен, что и рецептор ЭФР. Завершением этой стадии, которую можно считать стартом пути на лизосомную деградацию, является фосфорилирование HRS по тирозину, вследствие чего он дисоциирует в цитоплазму, а его место занимает ESCRTI, компонентами которого являются белки TSG101, Vps28, Vps37 (HCPR1) и, возможно, Bcr, которые также имеют UBA-домены (TGS101) и FYVE-домены. Пока неясно, как координируются ЕЕА1-зависимые циклы слияния и Са2+- опосредуемое ингибиторное действие HRS на формирование активного SNARE-комплекса, описанное в главе, посвященной роли кальция в регуляции слияний.
Следующими в очереди стоят комплексы ESCRII (Eap30, Eap25, Eap45 и Eap20) и ESCRIII с самым богатым белковым составом (CHMP1A, CHMP1B, CHMP2 A, B, CHMP3, CHMP4 A, B, C, CHMP5, CHMP6 и CHMP7). Два последних комплекса появляются на уже достаточно зрелых эндосомах и занимаются концентрированием убиквитинированного груза в компактные кластеры на PI3P-платформе, на основе которой, начинают формироваться инвагинации для будущих внутренних пузырьков МВЭ. Механизм образования таких инвагинаций неизвестен, но ESCRT-комплексы, особенно ESCRTI, по-всей видимости, имеют к нему непосредственное отношение.
Перед попаданием во внутренние пузырьки рецептор деубиквитинируется. Первоначально считали, что однажы убиквитинированный в ранних эндосомах рецептор деуби-квитинируется убиквитин-специфической протеазой Y (UBPY, или USP8) непосредственно перед упаковкой в пузырьки. Однако позднее была идентифицирована другая протеаза, AMSH (associated molecule with the Src homology 3 (SH3) domain of STAM). Интересно, что оба DUB взаимодействуют со STAM, хотя AMSH, возможно вовлечена в регуляцию рециклирования, деубиквитинируя груз на довольно ранней стадии и тем самым выводя его из-под действия нижележащих сортирующих комплексов, тогда как UBPY требуется для лизосомной деградации рецептора. Непонятно, насколько скоординирована, и координируется ли вообще работа этих двух ферментов, но подавление ТК активности рецептора на любой стадии эндоцитоза, приводящее к диссоциации рецептора с убиквитин-лигазой с-Cbl, вызывает практически полное деубиквитинирование рецептора. Можно предполагать, что убиквитинирование/деубиквитинирование происходит постоянно, и это подтверждается изменением профиля убиквитинирования по ходу эндоцитоза. Неизвестно, обладают ли эти профили специфичностью.
Последним актом созревания поздних эндосом является рекрутирование «раздевающей» АТФазы VPS4, которая способствует разборке окаймления из ESCRT-комплексов, после чего поздняя мультвезикулярная эндосома готова к образованию гибридной органеллы с лизосомами.
Как именно определяется иерархия взаимодействий сортирующих комплексов с рецептором, неясно. Возможно, каждый последующий комплекс способен узнавать рецептор с определенныи профилем убиквитинирования. Несомненно также, что наличие постоянного транспорта из транс-сети АГ в эндосомы приводит к постепенному изменению липидно-белкового состава мембраны эндосом (созреванию), и для взаимодействия с эндосомой каждого комплекса важно наличие не только PI3P, но и определенных минорных липидов или белков, последовательно появляющихся в мембране.
АГ, также как и основная часть лизосом, локализуются в околоядерной области, так что доставка туда поздних эндосом неслучайна. Как уже упоминалось, эндосомы заякориваются на плюс-концах динамичных микротрубочек с помощью линкерных и кэпирующих белков и передают эндосому на динеин-динактиновый комплекс. Связывание ранней эндосомы с динеином также требует активного Rab5 и PI3P.
Можно было бы предполагать, что этого вполне достаточно для спокойного путешествия вглубь клетки. Однако картина все более и более усложняется. Так, к делу на поздних стадиях подключается малая ГТФаза Rab7, которая считается маркером поздних эндосом. Никаких слияний Rab7 не опосредует, зато участвует в кластеризации эндосом через взаимодействие с МТ. Во-вторых, механизм поддержания динамичности МТ, похоже, также регулируется рецептором. В нестимулированных ЭФР клетках деацетилаза HDAC6 локализована на плазматической мембране за счет связи с неактивированным рецептором. При его активации она переходит на МТ и деацетилирует их. Интересно, что выводится она из игры также рецептор-зависимым фосфорилированием по тирозину, и событие это, как считают, происходит через 30 мин после стимуляции эндоцитоза, т. е. когда процесс сортировки уже прошел несколько стадий. Все это создает весьма интригующую коллизию вокруг временн о й регуляции эндоцитоза, так как недавно было показано, что HDAC6 ассоциирована с рецептор-содержащими эндосомами и конкурирует за связывание с МТ не с кем иным, как с убиквитин-лигазой с-Cbl. Эти данные нуждаются еще в дополнительной проверке, однако они поддерживаются наличием двух стадий взаимодействия эндосом с МТ и многофункиональностью с-Cbl. Эксперименты подтверждают, что наиболее активное перемещение ранних эндосом по МТ происходит по динамичным микротрубочкам, зато на поздних стадиях (после 30 мин) МТ становятся высокоацетилированными и ассоциированы с укрупненными, уже кластеризованными в околоядерной области эндосомами. Вообще эндоцитозная машинерия имеет много возможностей вмешиваться во взаимодействие эндосом с МТ. Так, например, весьма интригующи данные о прямом взаимодействии TSG101, компонента ESCRTI-комплекса, и белка статмина, способного деполимеризовать МТ. Компонент ESCRTIII CHMP1B связывает другой МТ-повреждающий белок, спастин, и малую ГТФазу RhoA, которая, таким образом, вовлекается в регуляцию динамики и актиновых микрофиламентов, и МТ. Кроме того, спастин, CHMP1A, CHMP1B и Vps4 обладают доменами взаимодействия с МТ (microtubule interacting domain, MIT).
Картина еще больше усложняется, если учесть все возрастающее количество обнаруженных в мембране эндосом ионных каналов разной специфичности, в том числе кальциевых рН-зависимых и независимых, вакуолярной протонной помпы, ацидифицирующей люмен эндосом, и NADPH-оксидазы, продуцирующей супероксид-анион внутрь эндосом. Время достижения определенного уровня рН, регулирующего работу рН-чувствительного кальциевого канала, и определяющего диссоциацию многих лиганд-рецепторных комплексов, может зависеть от баланса активностей помпы и NADPH-оксидазы, а локальная концентрация перекиси на внешней стороне эндосомы - регулировать длительность фосфорилирования рецептора. Время, уровень и длительность выхода Са2+ из эндосом в результате может влиять как на эффективность слияний эндосом (через HRS) и лизосом, так и на структуру микротрубочек в непосредственной близости от эндосомы. Все вместе создает исключительно сложную и динамичную систему регуляции процесса эндоцитоза, выстроенную во времени и в пространстве.
12. ЭНДОЦИТОЗ И ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА
Поступление ЭФР-рецепторных комплексов в эндосомы и их поcледующая деградация в лизосомах были продемонстрированы на самом начальном этапе исследований механизма действия ЭФР в конце 70–начале 80 гг прошлого века. Поскольку основная парадигма в то время связывала стимуляцию сигнала только с плазматической мембраной, эндоцитоз долго рассматривали как простой механизм погашения избыточного сигнала, петлю обратной отрицательной связи. Демонстрация того, что рецептор в эндосомах долго сохраняет тирозинкиназную активность, породила гипотезу об участии рецептора в эндосомах в проведении сигнала. Основной вопрос заключался в следующем: поддерживают ли эндосомы сигналы, стимулированные на поверхности, или способны генерировать некие собственные, отличные от поверхностых, сигналы. Не останавливаясь долго на истории исследований, можно сказать, что в настоящее время в сигнальной функции эндосом сомнений нет.
Возвращаясь к рецептору ЭФР, можно выделить несколько «сигнальных» стадий (рис. 47). Так, единственный сигнал, который характерен только для поверхностно-локализованного рецептора, является стимуляция активности фосфолипазы Сγ (PLCγ), участ-вующей в обмене фосфоинизитидов и регулирующая InsP3-зависимое опустошение ЭПР по Са2+.
Сразу после интернализации на относительно коротком начальном этапе рецептор-содержащие эндосомы уже рекрутируют Rab5, но еще не ассоциированы с ЕЕА1 и не участвуют в слияниях. В этот момент рецептор взаимодействует с белком APPL1/2 (Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif) через РТВ-домен. В ответ на ЭФР или окислительный стресс, APPL1 транслоцируется с мембран эндосом в ядро, где взаимодействует с NuRD/MeCP1 (nucleosome remodeling and histone deacetylase multiprotein complex) – регулятором структуры хроматина и экспрессии генов, подготавливая клетку к стимуляции генов раннего ответа и, таким образом, участвуя в регуляции пролиферации. Для функционирования APPL-белков необходима связь с Rab5.
Далее в игру может вступать STAM, партнер HRS по ESCRT0-комплексу; под действием IL-2 он ассоциируется с Janus киназой и индуцирует экспрессию с-myc. Интересно, что рецептор-стимулируемый активатор Rab5 RIN1 взаимодействует со STAM2. Профиль тирозинового фосфорилирования HRS-STAM комплекса при действии ЭФР, PDGF, HGF различается, что может быть основой различия и в дальнейших сигнальных путях. Кроме того, STAM действует и на биосинтетическом пути, ассоциируясь с COPII- везикулами Sar1p-зависимым образом и регулируя морфологию
Рис. 46. Этапы эндоцитозного пути рецептора ЭФР, которые
вовлечены в генерацию сигналов с эндосом. Влияние внешних
сигналов (внеклеточного контекста) на сами сигнальные белки
может модулировать общий клеточный ответ
аппарата Гольджи: при оверэкспрессии STAM АГ фрагментируется, а при нокауте – коллапсирует в области ЦОМТ. Это поведение напоминает наблюдаемое при манипуляциях с цитоскелетом.
Еще одни белок, TOM1L1, является партером как HRS (компонента ESCRT0), так и Tsg101(компонента ESCRTI). Он имеет несколько остатков тирозина, фосфорилируемых киназами Src-семейства, что определяет его взаимодействие с GRB2 и PI3-киназой р85. Это вовлекает его в регуляцию и МАР-киназного пути, и р85-зависимых путей, и в модификации цитоскелета.
 |
Рис. 47. Сборка МАР-киназного каскада на плазматической
мембране и на поздних мультивезикулярных эндосомах
происходит с использованием разных адаптеров
Считается установленным фактом, что все компоненты МАР-киназного каскада собираются не только на поверхности, но и на эндосомах (рис. 47). Однако недавно было показано, что на плазматической мембране каскад собирается с помощью адаптера KSR1, а на поздних мультвезикулярных эндосомах – с помошью адаптерного комплекса р14/MP1. Причины такой организации каскада неясны, однако разные способы сборки дают возможность дополнительной регуляции сигналинга. В частности, одним из следствий двухстадийности является то, что полная активация МАР-киназы происходит только тогда, когда рецептор проходит весь деградационный путь; если же рецептор в основном рециклирует, то МАР-киназа активируется не полностью.
Самым «физиологичным» доказательством сигнальной роли эндосом была демонстрация того, что два уже упоминавшихся природных лиганда рецептора ЭФР, стимулирующие путь лизосомной деградации (сам ЭФР) или рециклирования (TGFα), обладают разной способностью активировать экспрессию ингибитора CDK p21/CIP1 в клетках А431. Если ЭФР стимулирует экспрессию р21, то второй лиганд не стимулирует. Обработка клеток Бафиломи-цином А, подавляющим протонную помпу и препятствующим таким образом диссоциации TGFα и рецептора, сохраняет ТК-активность последнего и в результате перенаправляет рецептор с пути рециклирования на путь, ведущий в лизосомы. Эта обработка также приводит к стимуляции экспрессии р21, что ясно указывает на поздние эндосомы как на внутриклеточный сайт, с которого идет сигнал на экспрессию р21.
Способность организовывать различные сигнальные каскады, которые, в свою очередь, подвержены множественной внешней регуляции, приводит к тому, что временн ы е параметры эндоцитоза, даже в клетках одной и той же линии, могут меняться в весьма широких пределах в зависимости от внеклеточного сигнального контекста. Так, интернализованный ЭФР-рецепторный комплекс может быстро, за 15–30 мин пройти весь путь до лизосом и деградировать уже через час после стимуляции эндоцитоза. Но в некоторых случаях он будет преимущественно рециклировать, а в других – оставаться в ранних эндосомах в течение нескольких часов. Такая «нестабильность динамики» эндоцитоза, скорей всего, отражает факт наличия множественных сигнальных путей и множества их мишеней на эндоцитозном пути, активность которых способна модифицироваться в зависимости от сигнального контекста, даже в столь редуцированной системе, как система культивируемых клеток. Небольшие неконтролируемые изменения состава сыворотки, наличие или отсутствие каких-то ростовых факторов и гормонов могут привести к изменению динамики эндоцитоза и в конечном итоге, к изменению клеточного ответа на экспериментально добавляемый стимул. Таким образом, эндоцитоз нельзя рассматривать в качестве строгого часового механизма, скорее, это один из механизмов адаптации к условиям внешней среды.
13. ПАТОЛОГИИ, СВЯЗАННЫЕ
С НАРУШЕНИЕМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ТРАНСПОРТНЫХ СИСТЕМ
Нарушения в тонко регулируемой системе всегда ведут к возникновению разного рода дисфункций. Как следует из предыдуших глав, транспортная машинерия вовлечена в разные внутриклеточные процессы, включая регуляцию сигнализации. Поэтому список патологий, связанных с неправильной работой того или иного звена этой машинерии, растет с расширением наших знаний о молекулярных механизмах везикулярного транспорта.
Задачей этой главы не является систематизация всех известных на данный момент патологий, связанных с везикулярным транспортом. На отдельных примерах мы хотим представить спектр возможных нарушений и последствия, к которым они приводят. К ним относятся как ряд наследственных заболеваний, или синдромов, так и заболеваний, относительно природы которых нет единого мнения (например, нейродегенеративные патологии). Бактериальные и вирусные инфекции, действие ряда природных токсинов также связаны с везикулярным транспортом.
Среди наследственных заболеваний известен ряд так называемых лизосомных болезней накопления (ЛНБ). В зависимости от природы накапливаемых макромолекул различают четыре группы ЛБН: мукополисахаридозы, муколипидозы, гликопротеинозы и сфинголипидозы. Так, ряд липидозов (заболеваний, вызываемых накоплением липидов в клетках) связан с нарушением нормальной транспортировки липидов. При синдроме накопления сфинголипидов (GSLs), также как при экспериментальной оверэкспрессии холестерина, липиды вместо рециклирования на ПМ и доставки в АГ отправляются через поздние эндосомы в липидные депо и не участвуют в дальнейшем метаболизме. Большинство ЛБН связаны с мутациями в генах, кодирующих лизосомные ферменты. Но совсем недавно выяснилось, что муколипидоз IV-го типа, выражающийся в психомоторной ретардации и офтальмологических нарушениях, связан с мутацией в гене белка муколипина-1, кодирующего неселективный рН-зависимый катионный канал, в норме локализованный в мембранах поздних эндосом и лизосом. На клеточном уровне мутантный белок приводит к гиперацидификации лизосом и замедлению выхода из них липидов. Кроме того, мутантный муколипин-1 ускоряет эндоцитоз жидкофазных маркеров и приводит к появлению увеличенных эндолизосом.
Целый ряд синдромов связан с нарушениями в работе Rab- белков. Так, обнаружены мутации Rab–геранил-геранил-трансферазы (GGTase) и ее субъединицы REP1, работающей в первом после синтеза цикле Rab-белков, приводящие к нарушению пренилирования последних. Такие Rab-белки имеют дефекты взаимодействия с мембраной-мишенью. Часто подобные мутации фенотипически выражаются в частичном или полном альбинизме или нарушении пигментации, являющихся результатом «недопренилирования» Rab27а, отвечающего за транспорт меланосом в меланоцитах.
В основе хороидермии ― связанного с Х-хромосомой заболевания с медленным началом и течением, поражающего мужчин среднего возраста и ведущего к слепоте, лежит мутация REP1, приводящая к потере функции (loss-of-function mutation). Происходит дегенерация пигментного эпителия сетчатки и двух прилегающих к нему слоев – сосудистой оболочки глаза (choroid) и фоторецепторных клеток сетчатки, потому что не пренилируется Rab27а (возможно, и другие Rab-белки). Другая присутствующая в клетках человека форма этого белка, REP2 может компенсировать дефект REP1, но только частично.
Дефект в гене, кодирующем Rab27a, выявлен также у пациентов с синдромом Грисцелли (GS), характеризующимся следующим фенотипом: нарушения пигментации кожи и волос (частичный альбинизм); иммунные нарушения, а именно сниженная цитотоксичность Т-лимфоцитов, связанная с нарушением экзоцитоза в иммунологическом синапсе (место контакта Т-клетки и клетки-мишени) за счет loss-of–function Rab27a.
Еще одна наследственная патология – связанный с X-хромосомой синдром умственной ретардации, – сопровождается повышенной возбудимостью и склонностью к эпилептическим припадкам. В основе дежит мутация по гену, кодирующему RabGDIα–изоформу, экспрессирующуюся в основном в мозгу. RabGDIα работает с Rab3 и является негативным регулятором функционирования синапса. Мутантный RabGDIα не может удалить Rab3 c мембраны, в результате чего нарушается координированное высвобождение нейротрансмиттеров и рециклирование синап-тических пузырьков
Синдром Хермански-Пудлака (Hermansky-Pudlak syndrome, HPS) генетически гетерогенен, затрагивает ряд белков, и не все они известны. При нем наблюдаются частичный альбинизм, склонность к кровотечениям, дефекты функционирования лизосом и лизосомоподобных органелл (меланосом), лизосомное накопление липофусцина (ceroid lipofuscin). На молекулярном уровне выявлены дефекты в работе AP3-адапторного комплекса, в результате чего нарушается селекция груза в транс-сети АГ.
Большинство (но не все) вирусы входят в клетки с помощью эндоцитоза. Их можно разделить на две группы: представители первой (вирусы герпеса, папилломы, большинство рота- и ретровирусов) проникают в цитоплазму вне зависимости от рН, тогда как вход другой группы (рабдо-, адено-, парвовирусы) требует сниженного рН. На самом деле, рН-зависимость определяет путь входа в клетку: если первая группа проникает непосредственно через плазматическую мембрану, то вторые способны дестабилизировать мембраны только при сниженных рН, наблюдаемых в эндосомах. Таким образом, они сначала эндоцитируются, а потом уже из эндосом или кавеосом попадают в цитоплазму. Пути входа могут различаться – это и клатрин-окаймленные ямки, и макропиносомы, и кавеолы.
Борьбой с бактериальными инфекциями в организме занимаются профессиональные фагоциты, которые, опознав мембрану бактерии, стимулируют процесс фагоцитоза. Цель процесса – проведя бактерию по эндоцитозному пути, обеспечить созревание фагосомы и сделать ее компетентной для слияния с лизосомой, которая должна окончательно обезвредить бактерию. Клетки используют дополнительный механизм – так называемый рес-пираторный взрыв, при котором внутренний люмен фагосомы резко обогащается активными формами кислорода, повреждающих мембрану бактерии. В процессах респираторного взрыва важная роль принадлежит NADPH-оксидазе.
INFγ – цитокин, секретируемый NK-клетками. Его действие на макрофаги приводит к увеличению синтеза Rab5, что стимулирует формирование фагосом и рекрутирование на их мембрану NADPH-оксидазы.
Однако, как мы видим на практике, фагоциты не всегда справляются с поставленной задачей. Это, в частности объясняется тем, что бактерии вырабатывают свои стратегии противостояния деградации в лизосомах.
Так, micobacterium tuberculosis, или палочка Коха, «умеет» сделать так, что хотя фагосомы, ее поглотившие, и содержат Rab5, но не рекрутируют EEA1 и Rab7 (возможно, благодаря внедрению в мембрану фагосомы некоторых бактериальных липидов), а это препятствует созреванию фагосомы. Leishmania donovani экспрессирует липофосфогликан, также предотвращающий накопление Rab7 и созревание фагосом. Salmonella экспрессирует белок SopE, который является GEF для Rab5a, и таким образом, фагосома остается ранней. Как видно, препятствование созреванию фагосомы – основная стратегия, используемая бактериями для предотвращения их доставки в лизосомы.
Несколько иной способ использует Toxoplasma gondii, которая образует вакуоль (через макропиноцитоз), неспособную сливаться с эндосомами, но рекрутирующую митохондрии и ЭПР.
Кроме того, многие бактерии используют транспортную машинерию клетки-хозяина для своих собственных нужд, изменяя привычные транспортные пути.
Достаточно сложен путь, который проходит холерный экзотоксин. Он состоит из двух частей. Первая, отвечающая за связывание с клетками-мишенями, является пентамером субъединицы B. Второй, мономерный белок А, осуществляет АДФ-рибозилирова-ние альфа-субъединицы тримерного белка Ga. В конечном итоге токсин вызывает активацию аденилатциклазы и гиперпродукцию цАМФ, что приводит к выходу ионов и воды из эпителиоцитов кишечника, вызывая диарею и обезвоживание организма. Пред-полагали, что холерный токсин интернализуется и выходит в цитоплазму из эндосом. Оказалось, что его судьба в клетке гораздо сложнее. AB5 попадает в эндосому через клатрин-зависимый путь. Благодаря снижению рН происходит диссоциация комплекса на две части – В5 и А. Пентамер далее направляется в поздние эндосомы и деградирует в лизосомах. Везикула, содержащая субъединицу А, сли-вается с транс-мембраной АГ, а сама субъединица проходит возвратным путем через АГ и попадает в ЭПР. Здесь, под действием фермента протеиндисульфидизомеразы PDI, образуются два интер-медиата – PDI-SS-A1 и PDI-SS-A2. А1 после восстановления дисульфидной связи выходит из ЭПР в цитоплазму и активирует аденилатциклазу, приводя к конститутивному синтезу цАМФ.
Не менее драматичен и механизм действия токсина ботулизма – он непосредственно взаимодействует с синаптическими SNARE, разрушая их. В результате блокируется слияние синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной, прекращается передача нервного импульса и наступает паралич.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Картина представленных в настоящем пособии регуляции транспортых путей и описания процессов, в которых везикулярный транспорт, так или иначе, участвует, несомненно, весьма далека от завершенности. Более того, некоторые аспекты затрагивались бегло или вообще не затрагивались, поскольку основной целью этого издания является не охват все