Здесь целесообразно лишь вкратце повторить основные представления о фундаментальных жизненных процессах: редупликации ДНК, транскрипции ее с переносом наследственной информации на иРНК и механизме трансляции — синтезе белка, направляемом этой информацией.
Разумеется, по ходу дела мы сделаем некоторые уточнения и добавим ряд деталей к описаниям названных процессов.
Редупликацию ДНК (копирование «материнской» ДНК при делении клетки) осуществляет особый фермент ДНК-полимераза. Посадке этого фермента на одну из нитей ДНК предшествует строго локализованный разрыв кольца, если ДНК кольцевая (у бактерий) и некоторое расплетание концевого участка ее гигантской двунитевой спирали. Заметим сразу, что ДНК-полимераза может садиться на любой из двух концов спирали, но обязательно на ту нить, для которой этот конец является 3'-концом (будь то «кодирующая» или «защитная» нить). Продвижение фермента вдоль «матрицы» материнской нити всегда идет в направлении от 3'-конца к 5'-концу. Отсюда следует, что синтезируемая по этой матрице, «комплементарная» к ней новая нить ДНК будет начинаться своим 5'-концом и наращиваться в направлении своего будущего 3'-конца. Эти два направления нельзя путать. В случае сомнения достаточно вспомнить, что наращивание новосинтезируемой нити происходит путем последовательного присоединения нуклеотидов, уже несущих фосфатную группу, связанную с 5'-уг-леродом дезоксирибозы. Следовательно к предыдущему, уже стоящему на своем месте нуклеотиду он должен присоединяться по его ОН-группе, связанной с 3'-углеродом дезоксирибозы. А это и означает, что наращивание новой нити ДНК идет в направлении б'-3'. Здесь же уместно напомнить, что работа продвижения ДНК-полимеразы осуществляется за счет энергии разрыва химической связи между первым и вторым фосфатами соответствующего нуклеозидтрифосфата — предшественника присоединяемого нуклеотида.
Теперь перейдем к добавлениям и уточнениям. Начнем с того, что в клетке кишечной палочки (E.coli) обнаружилась не одна, а целых три ДНК-полимеразы. Они заметно отличаются друг от друга по молекулярному весу и по числу молекул каждой из них, содержащихся в клетке. А также по их роли в процессе редупликации ДНК.
Исторически первой была обнаружена и очищена ДНК-поли-мераза I (фермент Корнберга). Потом появились ДНК-полимеразы II и III, Молекулярные веса этих трех ферментов, соответственно, 109, 90 и 300 тыс. дальтон, а их представительство в одной клетке: 300, 40 и 20 штук. Различие функций будет видно из дальнейшего.
Описание 1-го этапа редупликации начнем с того, что первоначальное расплетание конца двунитевой материнской молекулы ДНК осуществляется с помощью специального белка «топоизоме-разы». Он продвигается по двунитевой молекуле, ослабляя ее водородные связи настолько, что на пройденном им коротком концевом участке эти связи разрываются уже при температуре 37°С. Вслед за топоизомеразой на материнскую ДНК садится и начинает продвигаться по ней другой белок ДНК-геликаза, которому предстоит сыграть свою роль позже. Затем особая РНК-полимера-за, работающая только с конца нити ДНК, именуемая «праймаза» строит очень короткую цепочку рибонуклеотидов (получившую название «праймера») комплементарно к началу нити ДНК. У бактерий это всего 5 нуклеотидов, а у эукариотов — порядка 40. (На рис. 28 все праймеры показаны тонкой линией, а все нити ДНК — жирной.)
Только теперь, сразу за праймером на ту же нить ДНК (условимся, для простоты, называть ее «первой») садится ДНК-поли-мераза, которая может начать строительство комплементарной нити ДНК только начиная от праймера, присоединяясь к нему(«танцует от печки»). Это — ДНК-полимераза III, самая крупная, состоящая из 6-ти субъединиц и по своей функции главная — она будет вести «комплементарный синтез» ДНК по этой первой материнской нити ДНК до самого конца. Первоначальное движение этой ДНК-полимеразы ограничено 1-2-мя тысячами нуклеотидов первой нити (у эукариотов — всего на 200 нуклеотидов).
Вторая материнская нить (еще пустая) формирует вместе с первой нитью «вилку редупликации».
Между геликазой и ДНК-полимеразой III образуется некоторый участок обнаженной 1-й нити. 2-я нить тоже еще ничем не прикрыта. Эти две нити после ухода геликазы могут вновь сомкнуться. Чтобы этого не происходило, вплотную за геликазой на 1-ю нить садятся четыре, так называемых «ДНК-связывающих белка». Им не приписывают иных функций, кроме защиты от восстановления двойной спирали ДНК близ вершины вилки...
Каждому, кто пробовал просто раздвинуть концы двух скрученных в спираль веревок (противоположные концы которых закреплены) знает, что сначала это удается сделать легко, потом все труднее, а затем становится и невозможно. Это происходит потому, что концы веревок именно раздвигаются, а не раскручиваются. Остальная часть спирали при этом уплотняется, сохраняя прежнее число витков, что и создает напряжение, мешающее дальнейшему раздвижению концов. Достаточно теперь у вершины вилки перерезать одну веревку, как плотно скрученная ее часть начинает вращаться до тех пор, пока напряжение уплотнения витков не будет снято. Одновременно будет вращаться вокруг своей оси и не перерезанная ветвь раздвинутой веревки. Отрезанная ветвь, если она сохранила какое-то сцепление, хотя бы в одной точке, с другой ветвью, будет без напряжения вращаться вместе с нею...
Подобный описанному процесс, вероятно, осуществляется и в ходе репликации ДНК. Пройдя до вершины вилки разошедшихся нитей материнской ДНК 'тандем геликаза-ДНК-связывающие белки — ДНК-полимераза III останавливается (см. рис. 28). Топо-изомераза уходит дальше по двухнитевой материнской ДНК, а ге-ликаза разрывает сахаро-фосфатную связь на 2-й нити. Уплотненные на участке, прилегающем к вилке, витки двойной спирали расправляются, 1-я нить ДНК вместе с сидящими на ней белками вращается вокруг своей оси, а вокруг этой нити поворачивается и отрезанный кусок 2-й нити, временно связанный с геликазой. Этот кусок называют «фрагментом Оказаки» — по имени ученого, обнаружившего появление таких фрагментов при редупликации. После снятия напряжения нити двойной спирали материнской ДНК снова могут начать расходиться. Но до этого с отрезанного конца фрагмента Оказаки другая праймаза начинает на нем построение нового рибонуклеотидного праймера. Затем геликаза освобождает фрагмент и уходит вперед, а специальный фермент «лигаза» пришивает начало фрагмента Оказаки на прежнее место — ко 2-й нити материнской ДНК. Заметим, что лигаза (М=96 тыс.) в клетке E.coli представлена наиболее многочисленной популяцией — около 200 молекул. Из чего следует, что она выполняет не случайные «ремонтные» работы, а является полноправным членом совокупности ферментов, обеспечивающих редупликацию ДНК (подобно значению ниток для хирурга).
Когда праймер готов, впереди него, по направлению к 5'-кон-цу 2-й материнской нити ДНК садится ДНК-полимераза I. Начинается строительство нити, комплементарной к этому фрагменту 2-й нити, опять в направлении 3'— 5', считая по этой нити. ДНК-полимераза I доходит до конца фрагмента Оказаки и снимается. Этим заканчивается 1-й этап редупликации (рис. 28).
Между тем праймер, оставшийся в начале 1-й нити разрушается некой «рибонуклеазой Н», — ферментом, рвущим нить РНК, находящуюся в комплексе с нитью ДНК. На его место ДНК-полимераза II ставит «правильные дезоксирибонуклеотиды. В то же время топоизомераза, геликаза, а за ними и ДНК-полимераза III продвигаются вперед. Начинается 2-й этап редупликации. Вилка репликации тоже продвигается, прилегающий к ней участок материнской двунитевой ДНК уплотняется и весь синтезирующий тандем останавливается. Геликаза опять разрезает 2-ю нить, образуя второй фрагмент Оказаки. Так же, как раньше, на обрезанном (временно) конце фрагмента создается праймер, к нему «подсаживается» ДНК-полимераза I и начинает копировать второй фрагмент Оказаки, т.е. 2-ю нить материнской ДНК. Отличие второго этапа будет только в том, что на пути этой полимеразы встретится праймер, оставшийся от копирования 1-го фрагмента Оказаки. Но ДНК-полимераза I, в отличие от всех прочих ДНК-полимераз, обладает еще и 5'—3' экзонуклеазной активностью, т. е. в направлении своего движения. Она разрушает праймер и доходит до того
места, с которого начинала копирование 1-го фрагмента Оказаки ее предшественница. Остается только связать фосфодиэфирной связью эти два куска новосинтезированной комплементарной нити. Естественно, что это делает вездесущая ДНК-лигаза.
Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений. '
Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме.
Конечно, все описанные механизмы были установлены для E.coli и подтверждены для других микроорганизмов. Имела ли смысл вся эта огромная работа, с точки зрения познания процессов передачи наследственной информации у высших организмов? Безусловно имела! Во-первых, исследователи не раз убеждались в том, что фундаментальные реакции на разных уровнях развития организмов протекают сходным образом. Во-вторых, ферменты, выделенные из бактерий, хорошо ведут in vitro редупликацию ДНК, полученных из любых источников, и потому представляют собой прекрасный инструмент для исследования этих ДНК.
Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: ос, Р, у, 5 и е. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза 5. ДНК-полимераза а отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза Р — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза у ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы с пока неизвестна.
Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек (как — непонятно). Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы 5 служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований.
Отметим еще, что все ДНК-полимеразы, ведущие комплеметарный синтез, как у бактерий, так и у эукариотов, обладают еще и экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5', — обратном направлению синтеза. Они способны как бы «обернуться» и удалить только что ими же присоединенный нуклеотид. Это — очень важный механизм устранения ошибок в комплементарном синтезе. Ошибку ведь можно обнаружить только тогда, когда она уже сделана. И немедленно исправить! Это «умеют» делать ДНК-полимеразы. Такая коррекция не редкость, а норма. Считают, что без нее при редупликации ДНК из E.coli 5—10% нуклеотидов были бы присоединены неправильно. Благодаря коррекции 1 ошибка в этой ДНК приходится на десять миллионов пар оснований. Всем бы корректорам такую тщательность!
Литература:
Ахмеджанов М.Ю., Гуз С.Я., Архангельский В.В. Динамика содержания триглицеридов, общего холестерина и его фракций в сыворотке крови больных, перенесших инфаркт миокарда и при санаторно-курортном лечении. // Новое в лабораторной диагностике хронических болезней внутренних органов. - Ужгород, -1983. -С.52.