Практическое занятие № 5. Методы изучения генетики человека
Цель и задачи: изучить основные и экспресс-методы изучения генетики человека. Научиться использовать закон Харди-Вайнберга для определения генетической структуры популяции,
Оснащение: учебники, справочники, таблицы:
Вопросы для самоподготовки
1. Человек как объект генетических исследований.
2. Близнецовый метод. Конкардантость и дискордантность. Формула Хольцингера
3. Популяционно-статистический метод. Закон Харди-Вайнберга
4. Цитогенетический метод
5. Биохимический метод. Методы рекомбинантной ДНК.
6. Экспресс - методы генетики человека
7. Методы пренатальной диагностики наследственных заболеваний.
Самостоятельная работа учащихся.
1. Заполните таблицу: «Методы изучения наследственности человека»
| Название метода | Сущость метода в диагностике наследственных заболеваний |
2. Изучите фотографии идиограмм человека. Дайте заключение о половой принадлежности на основании анализа пары гетерохромосом и о числе хромосом в кариотипе (рис.1, рис. 2).
3. Проанализируйте идиограмму кариотипа и поставьте диагноз.(рис. 3 - 7)
4. Решите задачи (вариант №1 – 1, 3, 5, 7; вариант №2 – 2, 4, 6, 7):
4.1. В паре близнецов один был мальчик, другой девочка. Как называют таких близнецов? Почему в данном случае оказалось возможным рождение мальчика и девочки?
4.2.У однояйцевых и двуяйцевых близнецов с врожденным вывихом бедра конкордантность составила соответственно 51,3 и 5,4%. свидетельствуют ли эти данные о наследственной обусловленности признака, если различия статистически достоверны?
4.3.Вследствие нарушения распределения хромосом в митозе во время одного из первых делений дробления могут появиться клоны клеток с различным числом хромосом. Если после ранней ошибки в митотическом распределении зарождаются однояйцевые близнецы, будут ли они различаться по своему хромосомному набору? Объясните дискордантность однояйцевых близнецов по синдрому Шерешевского-Тернера. Каковы их кариотипы, если оба близнеца: а) девочки; б) мальчики?
4.4 Если частота рецессивного аллеля альбинизма равна 0,01, то какова частота доминантного аллеля в популяции?
4.5.Частота встречаемости рецессивных гомозигот (аа) составляет 0,49. Какова в данной популяции частота встречаемости гетерозигот?
4.6. Гиперхолестеринемия (повышенное содержание в крови холестерина) является аутосомно-доминантным' признаком. Среди населения Европы Гиперхолестеринемия встречается с частотой 2:1000 новорожденных. Определите частоту доминантных и рецессивных генов по данному признаку.
4.7. В Европе частота дальтонизма (т.е. неспособность различать красный и зеленый цвета) составляет среди мужчин 0,08. Этот дефект обусловлен сцепленным с полом рецессивным аллелем d. Каковы частоты трех генотипов у женщин?
Рис. 1 Рис. 2
Рис.3 Рис. 4
Рис.5 Рис. 6 Рис. 7
Теоретическое обоснование
Медицинская генетика занимается:
- изучением патогенеза, клиники, диагностики, фармакологического и других видов лечения и профилактики наследственных болезней человека;
- исследованием механизмов наследственной предрасположенности и врожденной резистентности к мультифакториальным заболеваниям;
- разработкой генетических аспектов иммунитета, аллергии, трансплантологии, канцерогенеза, генной инженерии и др.
Изучение генетики человека связано с рядом особенностей и объективных трудностей:
1. сложный кариотип;
2. позднее половое созревание и редкая смена поколений;
3. малое количество потомков;
4. невозможность экспериментирования;
5. невозможность создания одинаковых условий жизни.
Для обследования больных и решения вопросов патогенеза наследственных заболеваний в медицинской генетике широко применяются общепринятые методы клинического обследования: ультрасонография, электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография, биохимические анализы биологических жидкостей, биопсия тканей и др. Однако имеется целый ряд специфических методов, с помощью которых можно изучать вопросы возникновения, развития, распространения наследственных болезней, механизмы их передачи из поколения в поколение, а также роль генотипа и факторов среды в их проявлении.
Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа, его применяют для диагностики хромосомных синдромов.
Они включают: определение полового хроматина; кариотипирование (кариотип - совокупность хромосом клетки), определение количества и структуры хромосом с целью диагностики геномных мутаций и хромосомных аберраций.
Показания для цитогенетического обследования больного:
- множественные пороки развития (трех и более систем);
- умственная отсталость в сочетании с нарушениями физического и полового развития;
- стойкое бесплодие у мужчин и женщин при исключении гинекологической и урологической патологии;
- привычное невынашивание беременности;
- нарушение полового развития (гипогонадизм, половые инверсии);
- небольшая масса ребенка, рожденного при доношенной беременности.
Хромосомные аномалии обусловливаются нарушением поведения хромосом во время мейоза. Примерами такого рода хромосомных аномалий у человека являются: синдром Дауна (трисомия-21), синдром Патау (трисомия-13), Синдром Эдвардса (трисомия-18), или возникают вследствие изменения числа половых хромосом: синдром Шерешевского – Тернера, трисомия-Х, синдром Клайнфельтера
Биохимический метод определяет метаболиты, специфические для наследственных болезней нарушения обмена веществ (энзимопатий).Он основан на изучении активности ферментных систем: либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой данным ферментом.
Биохимическому анализу подлежат моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, фибробласты и лимфоциты. Применяют хроматографические, флюорометрические, радиоиммунологические и некоторые другие методы. Они позволяют выявлять генные мутации — причины болезней обмена веществ (например, серповидно-клеточная анемия); могут применяться и как экспресс-методы
Биохимический метод широко применяется в медико-генетическом консультировании для определения риска рождения больного ребенка, а также для диагностики гетерозиготных состояний у взрослых.
Показания для биохимического исследования:
1) умственная отсталость, психические нарушения;
2) нарушение физического развития - аномальный рост и строение волос, ногтей; искривление костей туловища и конечностей, чрезмерное отложение жира, гипотрофия или кахексия, тугоподвижность или разболтанность суставов;
3) плохое зрение или полная слепота, тугоухость или глухота;
4) судороги, мышечная гипотония, гипер- и гипопигментация, желтуха;
5) непереносимость отдельных пищевых продуктов и лекарственных препаратов, частая рвота, диарея, жидкий стул, гепато - и спленомегалия; специфический запах мочи и пота;
6) мочекаменная болезнь, холестаз;
7) гемолитические анемии и др. состояния.
Близнецовый метод
Сущность близнецового метода заключается в сравнении внутрипарного сходства в группах моно - и дизиготных близнецов, что позволяет с помощью специальных формул оценить относительную роль наследственности и факторов среды в развитии каждого конкретного признака. При исследовании качественных признаков внутрипарное сходство оценивается по принципу «подобны - различны». Пары, в которых партнёры подобны друг другу по данному признаку, называются конкордантными. Если один из партнёров обладает данным признаком, а второй нет, то пара называется дискордантной. Например, по группе крови пара считается конкордантной, если оба партнёра имеют одну группу крови, но если группа крови различна, то пара дискордантна.
Для количественной оценки роли наследственности и срды применяют различные формулы. Чаще всего пользуются коэффициентами наследственности (Н) и влияния среды (Е), вычисленными по формуле Хольцингера:
Н = Сmz - Сdz: 100% - Сdz ∙ 100%, Е = 100% - Н
где Сmz – процент конкордантных пара в группе монозиготных близнецов, Сdz – процент конкордантных пар в группе дизиготных близнецов.
(Н = КМБ% - КДБ%: 100% - КДБ%; где Н — доля наследственности, КМБ — конкордантность монозиготных близнецов; КДБ — конкордантность дизиготных близнецов).
Коэффициент наследуемости для разных признаков различен. Если Н ≥ 70%, то признак определяется наследственными факторами; 50% < Н >70%, то признак определяется и наследственными и средовыми факторами; если Н ≤ 50% - признак определяется факторами среды.
Популяционно-статистический метод изучения генетики человека основан на использовании закона Харди—Вайнберга (1908) и позволяет определять частоту генов и генотипов в популяциях людей. Например, гомозиготы по гену HbS в Республике Беларусь практически не встречаются, а в странах Западной Африки частота их варьирует от 25% в Камеруне до 40% в Танзании (Ф. Фогель, А. Мотульски, 1990). Изучение распространения генов среди населения различных географических зон (геногеография) дает возможность установить центры происхождения различных этнических групп и их миграцию, определить степень риска появления наследственных болезней у отдельных индивидуумов.
Первое положение закона Харди-Вайнберга:
Сумма частот аллелей одного гена в данной популяции равна единице, т.е. p + q = 1, где p – частота доминантного аллеля А, q – частота рециссивного аллеля а (А+а =1). Обе величины обычно принято выражать в долях единицы, реже – в процентах (тогда p + q = 100%)
Второе положение закона:
Сумма частот генотипов по одному гену в данной популяции равна единице, т.е. p2 + 2 pq + q2 = 1: где p2 – частота гомозиготных особей по доминантному аллелю (генотип АА), 2 pq - частота гетерозигот (генотип Аа), q2 – частота гомозиготных особей по рецессивному аллелю (генотип аа).
Вывод этой формулы: В равновесной популяции женские и мужские особи имеют одинаковые частоты как аллеля А (p), так и аллеля а (q). В результате скрещивания женских гамет ♀ (p + q) с мужскими ♂ (p + q) и определяются частоты генотипов (p + q) х(p + q) = p2 + 2 pq + q2 = 1.
При полном доминировании, установив в данной.популяции число рецессивных гомозигот (q2 — число гомозиготных 'особей по рецессивному гену с генотипом аа), достаточно извлечь квадратный корень из полученной величины, и мы найдем частоту рецессивного аллеля а. Частота доминантного аллеля А составит р = 1 - q. Вычислив таким образом частоты аллелей а и А, можно определить частоты соответствующих генотипов в популяции (р2=АА; 2pq=Aa). Например, по данным ряда ученых, частота альбинизма (наследуется как аутосомный рецессивный признак) составляет 1:20 000 (q2). Следовательно, частота аллеля а в генофонде будет q2=l/20000 = /141 и тогда частота аллеля А будет p = 1 - q. р = 1. р = 1 - 1/141 = 140/141.
В этом случае частота гетерозиготных носителей гена альбинизма (2pq) составит 2(140/141) х (1/141) = 1/70, или 1,4%
Третье положение:
В равновесной популяции частоты аллелей и частоты генотипов сохраняются в ряде поколений.
Методы рекомбинантной ДНК позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот позволяет устанавливать порядок нуклеотидов в молекуле ДНК и обнаруживать единственный ген среди десятков тысяч. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.
Экспресс-методы - это методы быстрой предварительной диагностики наследственных болезней человека. Используются для обследования больших контингентов людей с целью выявления наследственной патологии.
К эспресс-методам предъявляются определенные требования:
- метод должен бьпь диагностически значимым;
- метод должен быть надежным;
- исследованию необходимо подвергать легко доступный материал (кровь, моча) в малых количествах (пятна капиллярной крови, высушенной на фильтровальной бумаге);
- метод должен быть приемлемым для обследуемых, исполнителей и врачей;
- метод должен быть, экономичным.
Микробиологический ингибиторный тест Гатри позволяет выявлять некоторые биохимические нарушения у новорожденных.
Биохимические методы позволяют выявить изменения в обмене веществ, для уточнения диагноза заболевания, установления гетерозиготного носительства.
Предположить наличие у больного наследственного дефекта обмена можно по следующим признакам:
умственная отсталость, изолированная или в сочетании с патологией других органов;
нарушение психического статуса;
нарушение физического развития;
судороги, мышечная гипо- или гипертония, нарушение походки и координации движений, желтуха, гипо- или гиперпигментация;
непереносимость отдельных пищевых продуктов и лекарственных препаратов, нарушение пищеварения и др.
Иммуногенетический метод - позволяет поставить или уточнить диагноз: 1) при врожденных иммунодефицитных состояниях; 2) при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови.
Биохимические и иммунологические экспресс-методы (флюорометрические, хроматографические, радиоиммунные и др.) широко используются для быстрой предварительной диагностики наследственных болезней обмена веществ, путём исследования Х- и Y-полового хроматина.
Определение полового хроматина используется в экспресс-диагностике хромосомных синдромов (таб. 3), при неясном поле новорожденного после 1 мес. жизни, первичной аменореи, нарушении менструального цикла, бесплодии у мужчин и женщин, недифференцированной олигофрении, при нарушении набора половых хромосом, в судебной медицине для определения пола индивида. Определение Х- и Y-хроматина - скрининговый метод, окончательный диагноз хромосомной болезни ставят только после исследования кариотипа.
Таблица №3 Содержание полового хроматина при различных состояниях
| Кареотип | Содержание полового хроматина | Когда определяется |
| 46, ХХ | Нормальный кариотип женщины | |
| 46, XY | Нормальный кариотип мужчины | |
| 45, Х0 | Синдром Шерешевского-Тернера | |
| 47, ХХY | Синдрома Клайнфельтера | |
| 47, ХХХ | Синдром трипло-Х | |
| 48, ХХХY | Синдрома Клайнфельтера | |
| 48, ХХХХ | Синдром поли-Х | |
| 49, ХХХХY | Синдром Клайнфельтера |
Дерматоглифический анализ – это изучение папиллярных узоров пальцев, ладоней и стоп. На этих участках кожи имеются крупные дермальные сосочки, а покрывающий их эпидермис образует гребни и борозды. Дермаюглифические узоры обладают высокой степенью индивидуальности и остаются неизменными в течение всей жизни. Поэтому дерматоглифический анализ используется для определения зиготности близнецов, диагностику некоторых геномных и хромосомных мутаций (например, болезни Дауна, Патау и других); для идентификации личности в криминалистике, установления отцовства в судебной медицине.
Трудности использования дерматоглифического анализа в медицине заключаются в отсутствии специфических изменений дерматоглифики для подавляющего большинства наследственных заболеваний.
Методы пренатальной диагностики – это совокупность исследований, позволяющих обнаружить заболевание до рождения ребенка. К основным методам пренатальной диагностики относятся: ультразвуковое исследование, амниоцентез, биопсия хориона, определение а-фетопротеина и др.
Показания для пренатальной диагностики:
- наличие в семье точно установленного наследственного заболевания;
- возраст матери старше 37 лет;
- носительство матерью гена Х-сцепленного рецессивного заболевания;
- наличие в анамнезе у беременных спонтанных абортов в ранние сроки беременности, мертворождений неясного гене- за, детей с множественными пороками развития и с хромосомной патологией;
- наличие структурных перестроек хромосом (особенно транслокаций и инверсий) у одного из родителей;
- гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при патологии с аутосомно-рецессивным типом наследования;
- беременные из зоны повышенного радиационного фона.
В настоящее время применяют непрямые и прямые методы пренатальной диагностики. При непрямых методах обследуют беременную женщину (акушерско-гинекологиче- ские методы, анализ сыворотки крови на альфа-фетопротеин). При прямых методах обследуют плод. К прямым неинвазивным (без хирургического вмешательства) методам относится ультрасонография, к прямым инвазивным (с нарушением целостности тканей) — хорионбиопсия, амниоцентез и фетоскопия.
Решение типовых задач
Задача 1. Частота заболевания сахарным диабетом в группе монозиготных близнецов составляет 65% (Сmz), в группе дизиготных близнецов – 18% (Сdz). Сделать выводы об относительной роли наследственных и средовых факторов в развитии этого заболевания.
| Дано: Сmz - 65% Сdz - 18% | Решение: 1. Используя формулу Хольцингера, определяем долю наследственной обусловленности признака: Н = Сmz - Сdz: 100% - Сdz ∙ 100% = (65 – 18): (100 – 18) ∙ 100% = 57% 2. Определяем влияние среды на формирование признака по формуле: Е = 100% - Н = 100% - 57% = 43% Ответ: Большая конкордантность в группе генетических идентичных партнёров монозиготных пар, доказывает, что в этиологии сахарного диабета наследственная предрасположение играет существенную роль. |
| Н -?; Е -? |
Задача 2. В популяции подчиняющейся закону Харди-Вайнберга, частоты аллелей А и а соответственно равны 0,8 и 0,2. определите частоты гомозигот и гетерозигот в первой генерации.
| Дано: Алелль а – 0,2 Алелль А –0,8 | Решение: 1.Частоты генотипов вычисляются по уравнению Харди-Вайнберга: p2 + 2 pq + q2 = 1, где p – частота доминантного аллеля А (0,8), q – частота рециссивного аллеля а (0,2). 2. Подставляем значения А и а в уравнение Харди-Вайнберга: 0,82 + 2∙0,8∙ 0,2 + 0,22 = 1 или 0,64 + 0,32 + 0,04 = 1. Ответ: частота доминантного гомозиготного генотипа (АА) – 0,64 частота рецессивного гомозиготного генотипа (аа) - 0,04; частота гетерозиготного генотипа (Аа) – 0,32. |
| АА -?, аа -?, Аа -? |
Задача 3. Кистозный фиброз поджелудочной железы поражает индивидуумов с рецессивным гомозиготным фенотипом и встречается среди населения с частотой 2 на 2000. Вычислите частоту носителей.
| Дано: q2 (аа)= 2 на 2000 | Решение: Частоты генотипов вычисляются по уравнению Харди-Вайнберга: p2 + 2 pq + q2 = 1, где p2 – частота доминантного гомозиготного генотипа, q2 – частота рециссивного гомозиготного генотипа, а 2 pq – частота гетерозиготного генотипа. 1. Так как кистозный фиброз поджелудочной железы поражает индивидуумов с рецессивным гомозиготным фенотипом, то мы можем найти q2: q2 = 1: 2000 = 0,0005 2. Находим частота рецессивного гена q: q = √ 0,0005 = 0,0244. 3. Исходя из уравнения: p + q = 1, находим p: p = 1 – q = 1 – 0,0244 = 0,9776. 4. Находим частоту гетерозиготного фенотипа 2 pq = 2∙0,9776∙0,0244 = 0,044 ≈ 5% Ответ: носители кистозного фиброза поджелудочной железы составляют около 5% от популяции. |
| 2 pq [2 Аа (%)]=? |
Задача 4. В популяции из 5000 человек 64 % способны свёртывать язык трубочкой (доминантный ген R), а 36% такой способностью не обладают (рецессивный ген r). Вычислите частоты встречаемости генов R и r и генотипов RR и rr в популяции.
| Дано: RR + Rr - 0,64 rr (q2) - 0,36, | Решение: 1. Исходя из того, что rr (q2) = 0,36, мы можем найти r: r = √ 0,36 = 0,6. 2. Исходя из уравнения: p + q = 1, находим p: p = 1 – q = 1 – 0,6 = 0,4, т.е. частота аллеля R (p) составляет 0,4. 3. Так как p = 0,4, то можно найти RR (p2): p2 = 0,4 ∙ 0,4 = 0,16. Значит, частота встречаемости лиц с генотипом RR составляет 16%. 4. Находим частоту гетерозиготного фенотипа 2 pq = 2 ∙ 0,4 ∙ 0,6 = 0,48 Ответ: частоты встречаемости генов: R - 0,4 и r - 0,6. Частоты генотипов: RR - 0,16; Rr - 0,48; rr - 0,36 |
| R -?, r -?, RR -? Rr -?, rr -?. |