ЗАНЯТИЕ № 1
ТЕМА: Введение в микробиологию. Основные формы бактерий. Современные методы микроскопических исследований. Основные подходы к систематике бактерий.
ЦЕЛЬ: усвоить определение: предмет, цели, задачи медицинской миробиологии. Рассмотреть и запомнить основные правила поведения и работы в бактериологической лаборатории. Рассмотреть принципы микроскопии. Изучить правила работы со световым микроскопом, особенности иммерсионной микроскопии. Изучить основные формы бактерий.
ПЛАН:
| №№ | Содержание занятия |
| Предмет и задачи микробиологии, цели и задачи медицинской микробиологии | |
| Краткий исторический очерк развития микробиологии как науки | |
| Оснащение и режим работы бактериологической лаборатории | |
| Основные формы бактерий | |
| Основные виды микроскопии: световая, темнопольная, люминесцентная, электронная. Основные правила микроскопии. | |
| Практическая работа |
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ:
1.Предмет и задачи микробиологии и медицинской микробиологии
1.1.Микробиология – наука, изучающая мельчайшие существа, закономерности их развития и изменения, вызываемые ими в окружающей среде
1.2.Медицинская микробиология – наука, изучающая свойства болезнетворных микробов а также процессы их взаимодействия с макроорганизмами, методы их диагностики, лечения и профилактики
1.3.Задачи медицинской микробиологии:
а) лабораторная диагностика инфекционных заболеваний
б) разработка и внедрение в практику работы здравоохранения лечебно-диагностических и лечебно-профилатических препаратов
2.Краткий исторический очерк развития микробиологии как науки
2.1.Основные периоды исторического развития микробиологии как науки и связанные с ними имена наиболее выдающихся ученых-микробиологов:
А. Описательный (морфологический) А.Левенгук (16-18 века )
Б. Физиологический (Л.Пастер, Р.Кох, Д.Ивановский (19 век)
В. Иммунологический (И.И.Мечников, Пауль Эрлих)(конец 19, начало 20 века)
Г. Молекулярно-генетический (современный) Эвери, Маклеод, Маккарти роль ДНК в качестве материальной основы наследственности 1928
3.Основные формы бактерий
3.1. Морфология бактерий – раздел микробиологии, изучающий форму, строение бактерий и их взаимное расположение относительно друг друга. Взаимное расположение определяется типом деления клеток, наличием капсулы, слизистого чехла, пилей.
3.2. Основные морфологические группы бактерий
| ШАРОВИДНЫЕ | ПАЛОЧКОВИДНЫЕ | ИЗВИТЫЕ | НИТЕВИДНЫЕ |
| Микрококки | Неспорообразующие | Вибрионы | Актиномицеты |
| Диплококки | Спириллы | ||
| Стафилококки | Спорообразующие | ||
| Стрептококки | |||
| Сарцины | Бациллы (аэробы) | ||
| Тетракокки | Клостридии (анаэробы) |
4.Тинкториальные свойства – отношение бактерий к красящим веществам (способность вступать во взаимодействие с красителями и окрашиваться определенным образом)
5.Виды микроскопии
5.1.Основные виды микроскопии: световая (в т.ч. фазово-контрастная и темнопольная), люминесцентная, электронная
5.2.Световая микроскопия основана на увеличении изображения объекта при прохождении света через линзы и объект Увеличение объектива Х увеличение окуляра = полезное увеличение
5.3.Разрешающая способность микроскопа – минимальное расстояние между двумя точками, на котором они воспринимаются раздельно. Для светового микроскопа последнее составляет 0,2 мкм.
5.4.Степень увеличения микроскопа определяется произведением увеличений объектива и окуляра
5.5.Иммерсионная система основана на прохождении света через иммерсионную среду (масло), при этом уменьшается рассеивание лучей в системе объект – масло – объектив.
5.6.Фазово-контрастная микроскопия основана на превращении изменения по фазе световой волны в изменение по амплитуде, улавливаемого глазом наблюдателя
5.7.Темнопольная микроскопия основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц (микроорганизмов)
5.8.Особенности люминесцентной микроскопии: использование способности к свечению (первичному или вторичному) под воздействием УФ-облучения. Имеется светофильтр, пропускающий только УФ-лучи.
5.9.Особенности электронной микроскопии: вместо световых лучей используется поток электронов с длиной волны значительно меньше световой волны. Разрешаюшая способность огромная (десятки и даже сотни тысяч раз)
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА
1.Микроскопическое исследование с применением иммерсионной системы препаратов микроорганизмов различной формы.
2.Зарисовка просмотренных препаратов.
3.Оформление и подпись протоколов.
4.Уборка рабочего места.
Подпись преподавателя
ЗАНЯТИЕ № 2
ТЕМА: “ Морфология, ультраструктура и химический состав бактерий. Простые и сложные методы окраски”.
ЦЕЛЬ: изучить основные морфологические группы микроорганизмов, состав и структуру бактериальной клетки, ознакомиться с методами окраски бактерий.
ПЛАН:
| №№ | Содержание |
| Современные подходы к систематике бактерий | |
| Основные морфологические группы микроорганизмов | |
| Структура и химический состав бактериальной клетки | |
| Протопласты, сферопласты, L-формы бактерий | |
| Сходства и различия строения клеток прокариотов и эукариотов | |
| Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий | |
| Этапы приготовления фиксированного мазка из культур бактерий | |
| Красители, применяемые в микробиологии. Механизм окраски бактерий. Простые и сложные методы окраски. | |
| Практическая работа. |
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ:
1.Современные подходы к систематике микроорганизмов
1.1.Классификация – распределение единиц по группам более высокого порядка.
1.2.Классификация служит для распределения микроорганизмов по группам более высокого порядка или для упорядочения многообразных организмов
1.3.Таксономия (систематика) – теоретическая дисциплина (или ее раздел), изучающая принципы и правила классификации и номенклатуры организмов.
1.4.Таксон – любая таксономическая группа, имеющая научное название.
1.5.Категории таксономии – ступени, ранги иерархической лестницы в биологической систематике.
1.6.КЛАССИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
МИКРООРГАНИЗМЫ– ЭУКАРИОТЫ(грибы, простейшие)
ПРОКАРИОТЫ– (цианобактерии, бактерии)
ВИРУСЫ(РНК-, ДНК-содержащие)
®®®®КЛАСС ®®® СЕМЕЙСТВО ®®РОД ® ВИД
1.7.Вид – (основная таксономическая категория) совокупность микроорганизмов имеющих единое происхождение и генотип, сходных по строению и физиологическим свойствам
1.8.Штамм – культура определенного вида микробов, выделенная одномоментно из того или иного источника или в разное время из одного и того же источника.
1.9.Клон – культура микроорганизмов, происходящих из одной клетки
1.10.Чистая культура –
1.11.Смешанная культура популяция бактерий 2-х и более видов
1.12.Микроскопический метод исследования применяется для изучения формы микробов, структуры бактериальной клетки и определения подвижности бактерий.
2.Ультраструктура и химический состав бактериальной клетки
2.1.Структура бактериальной клетки
| Компоненты | Функции |
| Обязательные | |
| Клеточная стенка | А)защитная, формообразующая |
| Цитоплазматическая мембрана | А)осмотический барьер Б)участие в дыхании в) участие в делении г) синтез клеточной стенки |
| Цитоплазма | Место локализации органелл |
| Рибосомы | Синтез белков |
| Мезосомы | Участие в энергетическом обмене, спосообразовании, делении |
| Нуклеоид | Носитель генетической информации |
| Необязательные | |
| Споры | сохранение вида, повышение выживаемости в неблагоприятных условиях |
| Капсула | Защитная роль, повышение выживаемости в макроорганизме |
| Жгутики | Двигательная (локомоторная) |
| Ворсинки | Участие в адгезии участие в коньюгации |
| Плазмиды | Носители внехромосомной генетической информации |
| Включения | Запас питательных веществ, отложение метаболитов |
3.Протопласты, сферопласты, L-формы бактерий
3.1.Сферопласты – бактерии, частично утратившие клеточную стенку в результате различных воздействий и утратившие способность к размножению.
3.2.Протопласты – бактерии, послностью лишившиеся клеточной стенки и не способные к размножению
3.3.L-формы – бактерии, полностью или частично лишившиеся клеточной стенки но сохранившие способность к размножению (стабильные не способны к реверсии в исходный вид, нестабильные – возможная реверсия в исходный вид после прекращения действия факторов, нарушающих синтез клеточной стенки)
3.Сходства и различия в строении клеток эукариотов и прокариотов
3.1.Общее в строении клеток эукариотов и прокариотов:
а) клеточное строение б) наличие цитоплазмы
в) наличие ЦПМ г) генетический материал – двунитчатая ДНК
3.2.Различия в строении клеток эукариотов и прокариотов
| Эукариоты | Прокариоты |
| Наличие дифференцированного ядра и ядрышек | Нуклеоид без ядерной оболочки и без ядрышек |
| Наличие эндоплазматического ретикулума | Отсутствие эндоплазматической сети |
| Наличие митохондрий | Митохондрий нет |
| Наличие аппарата Гольджи | Аппарата Гольджи нет |
| Диплоидный набор хромосом | ДНК двунитчатая, замкнутая |
| Имеются гистоны (ДНК) | В ДНК нет гистонов |
4.Строение клеточной стенки грамположительныйх и грамотрицательных бактерий
4.1.4.1.Основные различия в строении клеточной стенки грам(+) и грам(-) бактерий
| Признаки | Грам(+) | Грам(-) |
| Толщина в нм | 10-15 | 9-10 |
| Структура стенки | Однослойная однородная | 3-слойная неоднородная |
| Пептидогликаны | 95% | 5-10% |
| Тейхоевые кислоты | Имеются | отсутствуют |
| Белки | + | + |
| Липиды | 2,5% | 25% |
| полисахариды | нет | есть |
5.Методы окраски бактерий
5.1.Простые методы окраски бактерий – применение одного вида красителя
5.2.Сложные методы – последовательное применение нескольких красителей, протрав, дифференцирующих сред
6.Этапы приготовления мазка
6.1.Препараты для микроскопирования делятся на нативные (висячая, раздавленная капля) и фиксированные
6.2.Этапы приготовления фиксированного мазка
| Название этапа | Цель |
| 1. Приготовление мазка | Равномерное распределение материала по стеклу |
| 2. Высушивание | Удаление воды |
| 3. Фиксация | Обезвреживание бактерий и их фиксация к стеклу |
| 4. Окрашивание | Окраска бактерий или их частей |
7.Сложные методы окраски. Методы Грама и Нейссера
7.1.Основные этапы окраски мазков
| По Граму | По Нейссеру |
| 1. Генцианвиолет – 2 мин | 1. Метиленовый ацетат синий Нейссера – 2 мин |
| 2. Р-р Люголя - 2 мин | |
| 3. Этанол – 20 – 30 сек | 2. Промывание водой |
| 4. Промывание водой | 3. Раствор Люголя – 30 сек |
| 5. Фуксин – 2 мин | 4. Везувин – 30 сек |
| 6. Промывание водой | 5. Промывание водой |
| 7. Высушивание | 6. Высушивание |
ЗАНЯТИЕ № 3
“Споры, капсулы и жгутики бактерий.Кислотоустойчивые бактерии. Методы выявления спор, капсул и жгутиков”.
ЦЕЛЬ:Изучить процесс спорообразования у бактерий, методы выявления спор. Ознакомиться с особенностями кислотоустойчивых бактерий и методами их окраски. Изучить строение жгутиков у бактерий, капсулообразование, методы выявления жгутиков и капсул.
| №№ | Содержание |
| Споры и спорообразование | |
| Методы обнаружения спор | |
| Кислотоустойчивые бактерии и методы их выявления | |
| Капсулообразование и его значение | |
| Методы обнаружения капсул | |
| Жгутики, методы их выявления | |
| Ворсинки | |
| Практическая работа |
1.Споры и спорообразование
1.1. Спора – форма сохранения наследственной информации бактериальной клетки в неблагоприятных условиях внешней среды
1.2. У эукариот споры предназначены для размножения
1.3. У прокариот – для сохранения вида
1.4. Причины спорообразования –
А) недостаток питательных веществ Б) изменение рН
В) накопление метаболитов Г) недостаток влаги Д) изменение температуры окружающей среды
1.4.Стадии спорообразования (18-20 часов)
а) формирование спорогенной зоны; б) образование проспоры;
в) образование зрелой споры
1.5.Строение бактериальной споры
а) сердцевина б) внутренняя мембрана в) кортекс г) наружная мембрана д) оболочка споры е) экзоспориум
Процесс спорообразования а также характер расположения спор являются видовыми признаками.
1.6.Спорообразующие бактерии
| Таксономия | Морфология | Характер расположения спор |
| Род Bacillus | Палочки | Центральное |
| Род Clostridium | Палочки | Терминальное или субтерминальное |
| Род Sporosarcina | Кокки | центральное |
1.7.Факторы устойчивости спор:
а) низкое содержание свободной воды б) повышенная концентрация Са
в) наличие диколипинов г) многослойная оболочка
д) минимальная метаболическая активность (анабиоз)
1.8.Стадии прорастания споры (4-5 часов)
а) активация б) формирование клеточной стенки
в) истинное прорастание
2.Кислотоустойчивые бактерии
2.1.Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием липидов, воска, оксикислот (до 30-40%). К кислотоустойчивым бактериям относятся микобактерии туберкулеза и лепры. В состав микобактерий туберкулеза входят жирные кислоты: туберкулостеариновая, миколевая, фтионовая.
3.Капсулообразование и его значение
Капсула – поверхностная структура бактериальной клетки, имеющая слизистую консистенцию, прочно связанная с клеточной стенкой, структурирована
Примеры капсулообразующих бактерий – пневмококки, клебсиеллы
Капсулообразование может происходить
А. Только в макроорганизме (человек, животные)
Б. Постоянно присутствовать (клебсиеллы)
В. На питательных средах и в организме
3.4.Отличие капсулы от слизистого слоя – слизистый чехол имеет аморфную консистенцию, не структурирован, легко отделяется.
3.5.Толщина микрокапсул 0,2 мкм макрокапсул более 0,2 мкм
3.6.Химический состав капсул
а) вода до 90% б) полисахариды или мукополисахариды
3.7.Функции капсул
а) защитная б) дополнительный осмотический барьер в) препятствие действию бактериофагов г) адсорбция, адгезия
д) антигенность е) связь между клетками
Капсулообразование является видовым признаком и в этой связи используется для идентификации бактерий.
4.Жгутики
4.1.Жгутики – необязательные поверхностные структуры бактериальной клетки, являющиеся органоидами движения
4.2.Жгутики состоят из волокон флагеллина (сократительный белок типа миозина)
4.3.Базальное тельце – место прикрепления жгутика, система дисков, вмонтированная в цитоплазматическую мембрану бактерии
4.4.По расположению жгутиков бактерии подразделяются на а) монотрихи; б) лофотрихи; в) амфитрихи; г) перитрихи.
4.5.Характер и скорость движения микроорганизмов зависят от а) числа жгутиков; б) возраста культуры в) расположения жгутиков г) вязкости питательной среды д) температуры е) наличия определенных химических веществ
5.Ворсинки
5.1.Ворсинки (пили, фимбрии, филаменты) – поверхностные структуры бактериальной клетки, не выполняющите двигательных функций.
5.2.Типы пилей
| Признак | Пили 1 типа | Пили 2 типа |
| Количество | 100-1000 | 3-4 |
| Функция | Прикрепление(адгезия) | А) передача генетической информации Б) адсорбция бактриофагов В) рецепторные участки для РНК-содержащих вирусов |
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА
6.Методы обнаружения спор
6.1.Для выявления спор используются методы окраски
а) простые б) сложные
6.2.Окраска по методу Ожешки
Принцип метода: протравка соляной кислотой и нагревание способствуют разрыхлению оболочки споры и ее последующему прокрашиванию
Результат окрашивания: споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные формы – в синий
| Этап | Вещества | Время |
| Протравливание | 0,5% HCl при нагреве | 2-3 мин |
| Промывка | вода | |
| Фиксация | Пламя горелки | |
| Основной краситель | Карболобый фуксин Циля | 3-5 мин |
| Дифференцирующее вещество | 5% серная кислота | 2 мин |
| Промывка | вода | |
| Дополнительный краситель | Метиленовый синий | 3-5 мин |
| Промывка | вода |
7.Окраска фиксированных мазков по методу Циля-Нильссена
8.Приготовление мазка из культуры споровой палочки и окраска метиленовым синим
9.Выявление капсул по Бурри-Гинсу
| Этап | Вещество |
| Негативное контрастирование | Черная тушь |
| Высушивание | На воздухе |
| Фиксация | Пламя спиртовки |
| Окраска микробных клеток по Гинсу | Водный р-р фуксина |
| Промывка | вода |
Принцип метода: капсула, не воспринимающая красители из-за высокого содержания воды, не окрашивается и хорошо видна (не окрашена) на темном фоне. Вегетативная часть бактерии окрашивается фуксином в розовый цвет.
Результаты окрашивания: тело бактерии окрашивается в розовый цвет, неокрашенные капсулы видны на темном фоне.
10. Методы выявления жгутиков
Особенности препаратов “висячей” или “раздавленной”
капли:
а) объектив 8 х 40; б) вогнутое зеркало; в) слегка приоткрытая диафрагма; г) приопущенный конденсор; д) сухая (без иммерсии) оптика).
11.Приготовление препарата “раздавленная” капля из культуры кишечной палочки.
ЗАНЯТИЕ № 4
“Морфология и репродукция вирусов и бактериофагов. Принципы лабораторной диагностики вирусных инфекций. Методы культивирования вирусов и бактериофагов”
ЦЕЛЬ:ознакомиться с морфологией вирусов и бактериофагов, их репродукцией, методами культивирования и принципами диагностики вирусных инфекций.
ПЛАН
| №№ | Содержание |
| Вирусология как наука.История открытия вирусов | |
| Принципы классификации вирусов | |
| Морфология и строение вирусов | |
| Взаимодействие вируса с клеткой | |
| Определение и морфология бактериофагов | |
| Репродукция бактериофагов | |
| Практическое применение бактериофагов | |
| Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций | |
| Методы культивирования вирусов | |
| Выделение, идентификация и титрование бактериофагов | |
| Практическая работа |
ДОМАШНЕЕ ЗАДАНИЕ
1.Вирусология как наука
1.1.Вирусы – неклеточные формы жизни, обладающие собственным геномом и способные к воспроизведению лишь в клетках более высокоорганизованных существ.
1.2.Отличия вирусов от бактерий:
а) ничтожно малые размеры б) неклеточное строение
в) наличие в геноме одного вида НК г) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем д) размножение путем дизъюнктивной репродукции
е) способность к интеграции и кристаллизации
1.3.Вирусы были открыты Ивановским Д.И. 1892
2.Принципы классификации вирусов
2.1.Вирусы классифицируются:
А.по типу НК а) ДНК-содержащие б) РНК-содержащие
Б.по форме а) палочковидные б) сферические
В) нитевидные г) сперматозоидные
В.по размерам
А) а) мелкие 20 – 50 нм б) средние 50 –150 нм
в) крупные 200-400 нм
Г.по типу симметрии а) кубический; б) спиралевидный
в) смешанный
Д.по организации а) простые б) сложные
3.Морфология и химический состав вирусов
3.1.Соотношение формы вириона и типа симметрии
| №№ | Форма вириона | Тип симметрии |
| Палочковидная | Спиральный | |
| Нитевидная | Спиральный | |
| Сферическая | Кубический | |
| Сперматозоидная | Смешанный |
3.2. Особенности вирусных белков
а) высокая устойчивость к протеолитическим ферментам
б) способность к самосборке
3.3.Классификация вирусных белков по происхождению
а) вирионные (входят в состав вирионов)
б) вирусиндуцибельные (структура закодирована в геноме вируса)
в) клеточные ферменты (их активность модифицируется при взаимодействии с вирусом)
4.Взаимодействие вируса с клеткой
4.1.Стадии взаимодействия вируса с клеткой
а)адсорбция – начинается с нековалентных связей между рецепторами клетки и участками на поверхности вирусов, 1 фаза – неспецифическая, обратимая, 2 фаза – специфическая, необратимая
б)проникновение вируса в клетку происходит путем: рецепторного эндоцитоза, впрыскивания или слияния мембран
в)депротеинизация – освобождение вирусной НК от белковой оболочки
г)эклипс-фаза – репликация НК и синтез вирусных белков
д)сборка формирование вирионов из НК и белков
е)выход вируса из клетки путем лизиса, почкования, выход через мембраны или вакуоли
5.Определение и морфология бактериофагов
5.1.Бактериофаг – вирус бактерий
5.2.Морфологические формы фагов
а) нитевидная б) с коротким отростком
в) с аналогом отростка г) с несокращ.чехлом
д) без отростка е) с сокращ.чехлом
РНК- и ДНК-содержащие
6.Репродукция бактериофагов
6.1.Вирулентный бактериофаг осуществляет продуктивное взаимодействие, заканчивающееся лизисом бактериальной клетки
6.2.Умеренный бактериофаг после проникновения в клетку встраивается в геном клетки-хозяина (профаг)
6.3.Лизогения – включение ДНК умеренного фага в геном бактерии – хозяина
6.4.Лизогенная (фаговая) конверсия – проиобретение новых свойств лизогенными бактериями в результате внедрения в их геном умеренного фага
6.5.Профаг – умеренный бактериофаг, находящийся в интегрированном состоянии в геноме бактериальной клетки
7.Практическое применение батериофагов
диагностика, лечение, профилактика различных инфекционных заболеваний.
8.Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.
А) вирусоскопический Б) вирусологический В) биологический
Г) серологический
9.Методы культивирования вирусов
Сущность культивирования заключается в их накоплении с последующим изучением свойств
А) в организме восприимчивых животных Б) в куриных эмбрионах (метод овокультур) В) в культуре клеток
10.Культивирование вирусов в организме восприимчивых животных
10.1.Методы индикации в организме восприимчивого животного:
а) появление симптомов заболевания б) гибель животного
в) патоморфологические изменения в органах
10.2.Идентификация вирусов производится
серологическими методами
11.Метод овокультур
11.1.Метод овокультур – заражение вирусами развивающихся куриных эмбрионов
11.2.Способы индикации вируса в овокультуре
а) результаты овоскопии (отстутствие подвижности эмбриона и пульсации сосудов)
б) изменения на хорион-аллантоисной оболочке (отек, кровоизлияния, узелки)
в) отставание в росте г) гибель эмбриона
д) положительная реакция гемагглютинации
11.3.Реакция гемагглютинации в вирусологии – склеивание эритроцитов в присутствии некоторых вирусов
11.4.Идентификация вирусов производится с помощью серологических реакций
11.5.Преимущества метода
а) закрытая модель инфекции б) высокая чувствительность к многим вирусам
в) эффективный способ получения нгекоторых вакцин
г) доступность, дешевизна, простота применения
12.Выращивание вирусов в культуре клеток
12.1.Культура клеток – клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма
12.2.Культуры клеток классифицируются
а) первично трипсинизированные б) перевиваемые в) диплоидные
12.3.Методы индикации вируса, выращенного в культуре клеток
а) цветная проба б) цитопатогенный эффект в) внутриклеточные включения г) феномен интерференции д) положительная реакция гемагглютинации с культуральной жидкостью е) образование бляшек или стерильных пятен
12.4.Сущность цветной пробы Солка – сохранение первоначальной окраски питательной среды после заражения вирусом свидетельствует о заражении культуры вирусом
12.5.Цитопатическое действие – дегенеративные изменения культуры в результате заражения вирусом (появление симпластов, гиьбель части клеток и др.)
12.6.Метод бляшкообразования (феномен Дальбекко) образование в монолое клеток округлых бесцветных пятен указывает на наличие вируса
12.7.Механизм реакции гемагглютинации – фиксация вирусов на мембранах эритроцитов с последующим вовлечением их в агглютинаты (склеивание эритроцитов)
13.Выделение, идентификация и титрование бактериофагов
13.1.Выделение бактериофага осуществляется путем фильтрации исследуемого материала (содержащего фаг) через бактериальные фильтры или обработка его хлороформом для освобождении его от батерий и грибов.
13.2.Индикация и идентификация бактериофагов. Качественные пробы на бактериофаг.
А.Проба Отто. Сущность метода – доказательство присутствия фага – в месте попадания фага роста чувствительной культуры, появление мелких стерильных пятен (негативных колоний фага)
Б.Двухслойный метод Грациа – на питательный агар наносят расплавленный агар с исследуемым материалом и чувствительной культурой. После инкубации о присутствии фага судят по наличию прозрачных пятен на фоне глубинного роста бактерий
В.Метод Фишера (метод фаговых дорожек) – отсутствие роста чувствительной культуры в месте стекания капли с исследуемым фагосодержащим материалом
13.3.Определение количества фага (титрование)
а.титр бактериофага – максимальное разведение фагосодержащего материала, при котором отмечается лизис чувтвительных бактерий
б.индекс фага – количество бактериофага, содержащегося в единице объема материала (БОЕ/мл)
13.4.Титрование фага в жидкой среде по Аппельману – в ряд пробирок вносят кратные разведения фагосодержащего материала и индикаторную чувствительную культуру,после инкубации учитывают результат – отстутствие роста означает присутствие фага и результат (+), рост чувствительной культуры свидетельствует об отсутствии фага, результат (-).
13.6.Метод агаровых слов по Грациа
В пробирки с расплавленным агаром вносят индикаторную культуру и 1 мл (деляют кратные разведения) фагосодержащего материала. После инкубации подсчитывают число негативных колоний фага и делают пересчет на 1 мл неразведенного исследуемого материала.
ЗАНЯТИЕ № 5
ТЕМА “Метаболизм бактерий. Питание микроорганизмов. Ферменты бактерий”
1. Определение понятия “метаболизм бактерий”
1.1.Метаболизм – Совокупность происходящих в клетках процессов, направленных на жизнеспособность и воспроизводство биомассы.
1.2.Энергетический метаболизм (катаболизм) – процессы расщепления, идущие с выделением энергии и запасанием ее в молекулах АФТ и других макроэргических соединениях.
1.3.Конструктивный метаболизм (анаболизм) – комплекс реакций, в результате которых строится масса клетки за счет поступающих извне веществ с потреблением энергии.
2.Типы питания бактерий. Факторы роста
2.1.Классификация бактерий по типу питания
| По источнику углерода | По источнику питания | По донору электронов |
| 1.Автотрофы – синтезирующие все соединения из СО2 2.Гетеротрофы – использующие углерод органических соединений а)сапрофиты – нуждаются в готовых органических соединениях б) паразиты – зависят от макроорганизма в получении питательных веществ | 1.Фототрофы – используют солнечную энергию 2.Хемотрофы– получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций | 1.Литотрофы – используют неорганические соединения, H2,H2S,NH2 2.Органотрофы – получают электроны только из органических соединений |
2.2.Прототрофы – бактерии, способные синтезировать все необходимые вещества из глюкозы и солей аммония
Ауксотрофы – не способны синтезировать одно или более веществ для своего развития
2.3.Факторы роста – любые органические соединения, необходимые для роста и размножения, важнейшие группы:
1 .аминокислоты;
2 .пуриновые и пиримидиновые основания
3. липиды;
4 .витамины.
3.Механизм поступления питательных веществ в бактериальную клетку
- пассивная диффузия – транспорт питательных веществ в бактериальную клетку по градиенту концентрации, когда концентрация питательного вещества в среде выше такового внутри бактериальной клетки, протекает без затрат энергии
- облегченная диффузия – с участием ферментов пермеаз ЦПМ, при минимальных затратах энергии
- активный транспорт – транспорт питательных веществ с участием пермеаз, процесс требует затрат энергии
- транслокация – перенос питательных веществ одновременно с переносом химических групп (модификацией веществ), процесс сходен по своей сути с активным транспортом и также требует затрат энергии
-
4.Ферменты бактерий. Методы изучения ферментативной активности
4.1.Ферменты – высокоспециализированные белки, являющиеся катализаторами биохимических реакций.
Любой фермент характеризуется:
1) определенным оптимумом рН 2) сродством к своему субстрату 3)определенным температурным оптимумом.
4.2.Классификация ферментов
| По механизму действия | По локализации | По субстрату воздействия | По концентрации в окружающей среде |
| 1.Оксиредуктазы 2.Трансферазы 3.Лиазы 4.Гидролазы 5.Изомеразы 6.Лигазы | Экзоферменты – действующие вне бактериальной клетки Эндоферменты – функционирующие внутри клетки | 1.Сахаролитические 2.Протеолитические 3.Липолитические | Конститутивные синтезируются постоянно Индуцибельные их синтез инициируется наличием соответствующего субстрата |
4.3.Ферменты патогенности – ферменты, обусловливающие выраженное повреждающее действие на клетки и ткани макроорганизма – нейраминидаза, гиалуронидаза
4.4.Для определения сахаролитических свойств делают посевы выделенной “чистой культуры” на питательные среды “пестрого ряда”, среда Ресселя, Олькеницкого, Эндо,Левина, Плоскирева и другие.
4.5.Принцип использования сред Гисса (сред “пестрого ряда”) – бактерии, ферментирующие определенные углеводы (это видовое и специфическое свойство!) изменяют цвет среды (за счет выделения кислоты!) и, иногда образуется газ.
4.6.Назначение сред Эндо, Левина, Ресселя, Плоскирева – дифференциация бактерий, разлагающих лактозу от не обладающих такими свойствами, лактозо(+) и лактозо(-). Важнейшим индикатором потенциальной патогенности является признак лактоза(-)
4.7.Состав дифференциально-диагностических сред
| Состав | Эндо | Левина | Плоскирева |
| 1.Питательная основа | МПА | МПА | МПА |
| 2.Дифференцирующий фактор (сахар) | лактоза | лактоза | лактоза |
| Индикатор | Основной фуксин (обесцвеченный) | Метиленовый синий и эозиновый желтый | Нейтральный красный |
| Элективный фактор | Основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия | отсутствует | Нейтральный красный, соли желчных кислот |
4.8.Для выявления протеолитических ферментов используются
а)определение индола, сероводорода, аммиака, каталазы
газы выделяются, главным образом, при разложении триптофана, выделение индола (по Моррелю) определяют с раствором щавелевой кислоты, наблюдается розовое окрашивание; выделение сероводорода определяют с фильтровальной бумагой, пропитанной 20% раствором ускуснокислого свинца – выделяющийся индол вступает с ним во взаимодействие, в результате образуется сернокислый свинец, наблюдается почернение бумаги. Сероводород является продуктом распада серосодержищих аминокислот.
б)способность разжижать желатин
в) способность вызывать свертывание молока, сыворотки
5.Энергетический метаболизм бактерий"
Термины факультативный и облигатный указывают на возможность или невозможность переключения на иной тип питания, дыхания
Факультативный - необзязательный
Облигатный - обязательный
1)аэробы- факультативные и облигатные
2)микроаэрофилы - нуждающиеся в очень небольших количествах кислорода
3)аэробы (напр.холерный вибрион)
4)аэротолерантные - анаэробы, не нуждаются в кислороде, но последний не оказывает на них вредного влияния
Образование АТФ происходит в результате 3-х видов фосфорилирования
А) субстратное Б) окислительное В) фотофосфорнокислое
Брожение (субстратное фосфорилирование) - наиболее простой способ получения энергии, при котором происходит сопряженное окисление-восстановление субстрата без участия кислорода
Поделиться:
Поиск по сайту
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-08-20
Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных