Лекция «Ферменты антиоксидантной системы защиты организма. Каталаза и СОД.»

Каталаза является ферментом родственным пероксидазам. Это гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц, каждая содержит ион Fe³⁺. M_r фермента ≈ 240 кДа. Атом железа хелатирован с протопорфирином IX. Структура протопорфирина IX:

1) Каталаза осуществляет высокоэффективное разложение Н₂О₂ (k = 10⁷ М^-1∙с^-1);

2) Каталаза проявляет слабую (k = 10³ М^-1∙с^-1) пероксидазную активность, то есть, катализирует реакции окисления отдельных органических молекул перекисью водорода.

По классификации каталаза – «пероксид водорода: перкосид водорода-оксидоредуктаза», которая катализирует реакцию разложения пероксида водорода согласно реакции:

Видимо, каталаза присутствует во всех системах, где происходят процессы клеточного дыхания. Наибольшая активность каталазы выявлена в печени, крови (эритроциты) и в почках. В головном мозге она практически отсутствует. Каталитическая активность высокая – 44000 молекул Н₂О₂ разлагаются одним ферментом за 1 с. Каталаза характеризуется высоким значением K_m и эффективное разложение Н₂О₂ происходит при относительно высоких его концентрациях. Но высокие концентрации Н₂О₂, не характерные для естественных условий, инактивирюет ферментативную активность каталазы. Согласно литературным источникам они составляют ≈ 1-2% и выше. Допустим, 2% - 2 г в 100 г раствора - 20 г в 1 литре, С_m = 20/(34∙1 л) ≈ 0,6 М. Указанные концентрации недостижимы для организма и могут быть получены только in vitro.

In vivo защита каталазы от Н₂О₂ осуществляется НАДФН∙Н⁺. каждая субъединица тетрамерной молекулы каталазы связывает НАДФН∙Н⁺, что препятствует образованию неактивной формы каталазы под действием Н₂О₂.

Каталазы, полученные из различных источников, имеют довольно близкие M_r (225-251 кДа). Белковые компоненты каталаз специфичны, так как на введение каталаз из других животных в кровь кроликов вырабатываются антитела. У животных встречается заболевание – каталаземия. Дефицит каталазы в эритроцитах человека предрасполагает к гангрене полости рта.

Процесс разложения Н₂О₂ – не цепной, реакция не имеет периода индукции, а обычные реагенты, которые используются как маркеры радикальных процессов, не оказывают влияния на ее скорость. Н₂О₂ образует с каталазой три соединения. Лишь одно из них «соединение-I» зеленого цвета (λ_max = 405, 655 нм) обладает высокой каталитической активностью и участвует в ферментативном процессе. «Соединение-II» красного цвета (λ_max = 429, 536, 568 нм) образуется при действии избытка Н₂О₂, его каталитическая активность примерно в 10000 раз меньше, чем «соединения-I». Также обнаружено «соединение-III» (λ_max = 416, 545, 585 нм), образующееся при высоких концентрациях Н₂О₂, и оно каталитически не активно. Это объясняется следующим образом: после взаимодействия с 1 молекулой Н₂О₂ каталаза образует «соединение-I», взаимодействие которого с Н₂О₂ или ROOH дает конечные продукты. «Соединение-I» выступает в роли двухэквивалентного восстановителя, так что имеет место перенос двух электронов от связанной молекулы Н₂О₂ к свободной и образование Н₂О и О₂.

Формальная валентность иона железа в геме «соединения-I» равна +5. Каталаза имеет одну из самых высоких констант скорости катализируемой реакции среди ферментов. Активность каталазы подавляется CN^– и азидом, которые необратимо связывают железо в геме. Также ингибиторами являются: F^–, NH₂OH, NO^·, H₂S. Самым эффективным ингибитором является 3-амино-1,2,4-триазол, так как взаимодействует с «соединением-I».

Супероксиддисмутаза (СОД) (КФ 1.15.1.1) является ключевым ферментом АОС защиты организма, катализирующим реакцию дисмутации супероксид-анион радикалов:

.

Впервые выявлена МакКордом и Фридовичем в 1969 году. Они показали, что ускорение реакции дисмутации является физиологической функцией медьсодержащего белка эритрокупреина (гемокупреина), известного с 1938 г. Кроме иона Cu²⁺, фермент содержит атом Zn, поэтому название - Cu,Zn-содержащая СОД. Фермент ингибируется NaCN, можно экстрагировать смесью хлороформ-этанол.

Внутриклеточная СОД (Cu, Zn-СОД) димер состоит из двух субъединиц, каждая с M_r = 16.3 кДа. k = 2∙10⁹ М^-1∙с^-1 и не зависит от величины рН в интервале 4.8-10.2.

Внеклеточная СОД представляет собой гликопротеид, состоящий из 4 субъединиц, каждая из которых с M_r = 30 кДа (тоже содержит Cu²⁺и Zn²⁺) от цитозольной она отличается аминокислотным составом, антигенными свойствами, генными локусами. k значительно ниже, чем у первой. При аффинном разделении на гепарин-сефарозе выявлены три фракции внеклеточной СОД: А, В, С-фракции:

А - не имеет сродства к гепарину;

В - слабое сродство к гепарину;

С - сильное сродство к гепарину, способна связываться с другими глюкозаминогликанами.

То есть, in vivo, фракция С связана с гликокаликсом эндотелиальных клеток электростатическими связями (иммобилизованная форма). Фермент активен. Фракции А и В - в плазме. При введении больших концентраций гепарина (1000 Ед/кг), он вытесняет СОД фракции С с гликокаликса и переводит в плазму.

Суммарно выявлено:

1. Cu, Zn-СОД внутриклеточная

2. Cu, Zn-СОД внеклеточная

3. Mn-содержащая СОД митохондрий эукариотических клеток (также тетрамер, содержит Mn³⁺, каждая субъединица с M_r = 20 кДа), не ингибируется NaCN.

4. Fe-содержащая СОД - обнаружена только у прокариот (мономер с M_r = 39 кДа, ингибируется NaN₃).

Содержание Cu, Zn-СОД в тканях:

печень (до 350 мкг/г)

почки (185 мкг/г)

поджелудочная железа (165 мкг/г)

сердце, мозг, эритроциты (60-70 мкг/г)

жировая ткань и мышцы - меньше всего.

Активность Mn-СОД снижается: сердце > почки > печень > мозг > поджелудочная железа > мышцы > жировая ткань, логично, что нет в эритроцитах.

Например, в мозге: в глиальных клетках в 6 раз больше Cu, Zn-СОД, чем в нейронах. С возрастом активность СОД снижается.

В каталитическом центре находятся Cu²⁺, Mn³⁺ или Fe³⁺- соответственно Zn в Cu,Zn-СОД:

· в аллостерическом центре регулируется

· в центре связывания, захват .

Донором Н⁺, скорее всего, является гистидин, фермент инактивируется Н₂О₂.

Механизм: