Общие положения
Необходимым условием успешного ведения интенсивного рыбоводства и воспроизводства ценных видов рыб является тщательный контроль за физиологическим состоянием объектов выращивания. Кровь, как наиболее лабильная ткань, быстро реагирует на действие различных факторов и приводит к восстановлению равновесия между организмом и средой. Поэтому для ранней диагностики заболевании, в том числе и незаразных, наряду с паразитологическими, микробиологическими и вирусологическими исследованиями важное значение имеет анализ крови.
В рыбоводстве при гематологическом исследовании принято определять следующие показатели крови:
- количество гемоглобина,
- величину гематокритного числа,
- содержание общего белка в сыворотке крови,
- число эритроцитов,
- содержание гемоглобина в одном эритроците,
- средний объем эритроцитов,
- скорость оседания эритроцитов,
- число лейкоцитов,
- лейкоцитарную формулу,
- количество метгемоглобина.
В приложении приведена таблица, содержащая показатели крови здоровых рыб, и рисунки форменных элементов крови.
2. Взятие крови
2.1. Оборудование и реактивы:
- шприц с инъекционными иглами - стерильные,
- пастеровские пипетки - стерильные,
- часовое стекло,
-5 % раствор натрия цитрата или 0,2 % раствор гепарина (1.000 ЕД/мл),
- анестстики,
- спирт,
- мардя, вата.
2.2. Материал для исследования, ход работы Кровь берут у голодной рыбы, выдержанной в хорошо аэрированной воде в течение 5-10 минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из ансстетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1-1,5 %) и др. Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.
|
|
В зависимости от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.
Место пункции после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватньм тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой. Во избежание разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки (или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.
Приготовление и окраска мазков крови
По окрашенным мазкам крови ведут оценку активности эритропоэза и учет лейкоцитов.
3.1. Оборудование и реактивы:
- обезжиренные предметные стекла,
- шлифованное стекло для изготовления мазка,
- краска Май-Грюнвальда,
- рабочий раствор краски азур-эозина (по Романовскому),
- дистиллированная вода с рН 6,8 - 7,1, нейтрализованная фосфатными буферами.
3.2. Подготовка к исследованию
3.2.1. Подготовка предметных стекол.
- один конец стекла размером в 1-1,5 см шлифуют на наждаке для надписи простым карандашом,
- стекла кипятят в 1 %-ном растворе двууглекислой соды - 10 мин,
- охлаждают и промывают водопроводной, а затем дистиллированной водой - 5 мин.,
- стекла помещают в слегка подкисленный соляной кислотой раствор дистиллированной воды на 2-3 мин; затем дважды промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в сушильном шкафу и хранят в смеси спирта с эфиром 1:1. Перед употреблением их вынимают, насухо вытирают чистой салфеткой или фильтровальной бумагой. Они готовы к использованию.
|
|
3.2.2. Приготовление рабочего раствора краски азур - эозина:
- 5,5 мл концентрированной краски азур - эозина помещают в 250 мл нейтральной дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
3.3. Ход работы.
Кровь после взятия (см. п. 2.) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка. От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.
Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппснгсйму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой. Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.
|
|
4. Определение содержания гемоглобина
Гемоглобин - это дыхательный пигмент, содержащийся в эритроцитах. Его количество в организме выражается в г/л и имеет важное диагностическое значение. Определять содержание гемоглобина можно двумя способами: по Сали и цианметгемоглобиновым методом. Наиболее распространенным и простым является метод определения гемоглобина по Сали. Однако он дает ряд объективных (постепенное усиление окраски) и субъективных (визуальное сравнение цвета) ошибок. Цианметге-моглобиновьга метод является наиболее точным.
4.1. Метод определения гемоглобина по Сали.
4.1.1. Подготовка к исследованию
Приготовление 0,1 н. раствора соляной кислоты:
- на 1 л дистиллированной воды добавляют химически чистой 8,2 см3 соляной кислоты с удельным весом 1,19, либо 0,1 н. фиксанал соляной кислоты.
4.1.2. Оборудование и реактивы
- гемометр Сали,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- глазная пипетка,
- стеклянная палочка,
- часовое стекло,
- 0,1 н. раствор соляной кислоты,
- дистиллированная вода.
4.1.3. Ход определения и учет результатов В градуированную пипетку гемометра Сали до метки "2" глазной пипеткой наливают децинормальньгй раствор соляной кислоты. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают ее в раствор соляной кислоты. Полученную смесь перемешивают стеклянной палочкой и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени в пробирку по каплям доливают дистиллированную воду и, перемешивая стеклянной палочкой, подбирают цвет рабочего раствора до совпадения с цветом жидкости в стандартных пробирках. Количество ге-моглобина отсчитывают по нижнему мениску рабочего раствора на градуированной пробирке (показатели в г % выражают в г/л), 1 г % равен 10 г/л.
4.2. Цианметгемоглобиновый фотометрический метод
4.2.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Драбкина, на 1 л реактива берут:
Бикарбонат натрия - 1 г, красная кровяная соль
- 0,2 г, цианистый калий или натрий - 0,05 г, дистиллированная вода
-остальной объем.
4.2.2. Оборудование и реактивы:
- фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектротометр с зеленым светофильтром и кюветами толщиной 1 см;
- химические пробирки с пробками;
- капиллярная пипетка от гсмометра Сали объемом 20 мкл;
- градуированная пипетка на 5 мл;
- раствор Драбкина.
4 2.3. Ход определения и учет результатов.
Мерной пипеткой в пробирку наливают 5 мл трансформирующего раствора Драбкина. Пипеткой от гемометра Сали добавляют 20 мкл крови. Содержимое пробирки хорошо перемешивают и оставляют в холодильнике на 20 минут. По истечению этого времени рабочий и трансформирующий растворы наливают в кюветы и, используя зеленый светофильтр, проводят измерения на ФЭКе. Расчет концентрации гемоглобина (г/л) на основе данного определения проводят по формуле:
x=d540 x 367,1 г/л,
где: d 540 - показания ФЭК; 367,1 - коэффициент пересчета, учитывающий разведение крови, миллимолярный вес гемоглобина и другие показатели.
5. Определение гематокритной величины
Гематокритное число - это отношение объема эритроцитов к общему объему крови, выраженное в л/л (1 л/л равен 100 %).
5.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление растворов антикоагулянта:
- раствор Геллера и Пауля:
- на 100 мл воды: щавелевокислый аммоний - ],2 г, щавелевокислый калий - 0,8 г;
- 5 % раствор трсхзамсщенного лимоннокислого натрия.
5.2. Оборудование и реактивы:
- микрокапилляры,
- центрифуга, при массовом отборе проб удобнее использовать спе циальную центрифугу МГЦ - 8,
- растворы антикоагулянтов: раствор гепарина 1000 ЕД/мл или 7,7 мг/мл, или раствор Геллера и Пауля, или 5% раствор лимоннокислого натрия.
5.3. Ход определения и учет результатов.
Микрокапилляры предварительно обрабатывают одним из растворов антикоагулянта. Можно несколько раз сполоснуть их раствором гепарина и высушить при комнатной температуре или же в капилляры насасывают на 1/10 часть раствора Геллера и Пауля и высушивают в сушильном шкафу при 60°С. В подготовленные таким образом капилляры набирают кровь. Конец капилляра закупоривают с помощью замазки и ставят центрифугировать до получения постоянного объема эритроцитов. Время цснтри4)угирования зависит от скорости вращения центрифуги. Достигают эффекта полного осаждения эритроцитов. Отсчет объема эритроцитов и плазмы производят при помощи миллиметровой линейки. Процентное отношение столба эритроцитов к высоте всего столба крови является гематокритной величиной, которое переводят в размерность л/л.
6. Определение белка в сыворотке крови
Содержание белка в сыворотке крови рыб служит экспресс - тестом для определения уровня физиологического состояния рыб при выращивании в современных рыбоводных хозяйствах. Концентрацию белка выражают в г % или в г/л; 1 г/л равен 10 г %.
6.1. Оборудование и реактивы:
- уленгутки или небольшие пробирки,
- штатив,
- центрифуга,
- рефрактометр,
- пастеровские пипетки,
- спирт.
6.2. Ход определения и учет результатов
2-3 мл крови, полученной одним из методов (см. п.2.), помещают в подготовленные уленгутки или небольшие пробирки. После этого кровь центрифугируют 5 минут при 3000 об./мин. В случае отсутствия центрифуги проводят отстаивание крови в холодильнике 30 - 45 минут. Полученная после центрифугирования или отстаивания сыворотка отсасывается чистой пастеровской пипеткой и несколько се капель помещают на пластинку рефрактометра. Регистрируют показатель преломления по его шкале. По таблице 1, приведенной ниже, определяют содержаниебелка в сыворотке крови. После каждого исследования обе поверхности призм протирают марлевым тампоном, смоченным в спирте.
7. Определение числа эритроцитов пробирочным методом в камере Горяева
Число эритроцитов (в млн. в 1 мкл) - важный показатель физиологического состояния рыб, который характеризует наличие анемии.
7.1. Подготовка к исследованию.
Приготовление раствора Хендрикса:
- сульфат натрия - 20 г, хлористый натрий - 5 г, цитрат натрия трехзамещенный - 3 г, ледяная уксусная кислота - 100 мл, вода дистиллированная до 1 ()()() мл.
7.2. Оборудование и реактивы;
- химические пробирки с пробками,
- градуированная пипетка на 5 мл,
- капиллярная пипетка от гемометра Сали,
- пастеровская пипетка,
- камера Горяева,
- микроскоп,
- раствор Хендрикса.
7.3. Ход определения и учет результатов
Градуированной пипеткой в химическую пробирку наливают 4 мл раствора Хендрикса. В капиллярную пипетку от гемометра Сали набирают кровь до метки 20 мкл и выдувают в пробирку, осторожно промывая капилляр несколько раз. Покровное стекло притирают к камере Горяева до появления ньютоновских колец. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и пастеровской пипеткой заполняют камеру Горяева. Через 1-2 минуты начинают подсчет числа эритроцитов под микроскопом в 5 больших или 80 малых квадратах, расположенных по диагонали. Для определения количества эритроцитов в 1 мкл достаточно умножить полученное при подсчете число эритроцитов на 10000.
Таблица 1
Концентрация белка (в г %) при различном показателе преломления *
| Концентрация белка (в г %) | ||||||||||
| Показа- тель преломления | ||||||||||
| 1,337 | 0,60 | 0,66 | 0,72 | 0,77 | 0,83 | 0,89 | 0,95 | 1,01 | 1,07 | 1.12 |
| 1,338 | 1,18 | 1,24 | 1,30 | 1,36 | 1,41 | 1,47 | 1,53 | 1,59 | 1,65 | 1,70 |
| 1,339 | 1,76 | 1,82 | 1,88 | 1,94 | 2,00 | 2,05 | 2,11 | 2,17 | 2,23 | 2,29 |
| 1,340 | 2,34 | 2,40 | 2,46 | 2,52 | 2,58 | 2,63 | 2,69 | 2,75 | 2,81 | 2,87 |
| 1,341 | 2,93 | 2,98 | 3,04 | 3,10 | 3,16 | 3,22 | 3,27 | 3,33 | 3,39 | 3.46 |
| 1,342 | 3,51 | 3,57 | 3,62 | 3,68 | 3,74 | 3,80 | 3,86 | 3,91 | 3,97 | 4,03 |
| 1,343 | 4,09 | 4,15 | 4,20 | 4,26 | 4,32 | 4,38 | 4,44 | 4,50 | 4,55 | 4,61 |
| 1,344 | 4,67 | 4,73 | 4,79 | 4,84 | 4,90 | 4,96 | 5,02 | 5,08 | 5,13 | 5,19 |
| 1,345 | 5,25 | 5,31 | 5,37 | 5,43 | 5,48 | 5,54 | 5,60 | 5,66 | 5,72 | 5,77 |
| 1,346 | 5,83 | 5,89 | 5,95 | 6,01 | 6,07 | 6,12 | 6,18 | 6,24 | 6,30 | 6,36 |
| 1,347 | 6,41 | 6,47 | 6,53 | 6,59 | 6,65 | 6,70 | 6,76 | 6,82 | 6,88 | 6,94 |
| 1,348 | 7,00 | 7,05 | 7,1) | 7,17 | 7,23 | 7,29 | 7,34 | 7,40 | 7,46 | 7,52 |
| 1.349 | 7.58 | 7,63 | 7,69 | 7,75 | 7,81 | 7,87 | 7.93 | 7,98 | 8,04 | 8,10 |
| 1,350 | 8,16 | 8,22 | 8,27 | 8,33 | 8,39 | 8,46 | 8,51 | 8,57 | 8,62 | 8,68 |
| 1,351 | 8.74 | 8,80 | 8,86 | 8,91 | 8.97 | 9,03 | 9,09 | 9,15 | 9,20 | 9,26 |
| 1,352 | 9,32 | 9,38 | 9,44 | 9,50 | 9,55 | 9,61 | 9,67 | 9,73 | 9,79 | 9,84 |
| 1,353 | 9,90 | 9,96 | 10,02 | 10,08 | 10,13 | 10,19 | 10,25 | 10,31 | 10,37 | 10,4 |
*при наличии гемолиза необходимо из результатов определения общего содержания белка вычесть эксперименталыю установленную поправку на степень гемолиза: при " l " - 0,6 -0,7; при "++" 1,2 - 1,4; сильногемолиэированная сыворотка для определения общего содержания белка использована быть не может.
8. Определение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците (СГЭ)
Показатель среднего содержания гемоглобина в одном эритроците очень важен для выявления гипо- и гиперхромачии. СГЭ в одном эритроците принято выражать в пикограммах (синоним - микромикрограмм); 1 пг- КГ12 г.
8.1. Ход определения и учет результатов.
СГЭ в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина в 1 мкл крови, выраженной в грамм-процентах, на число эритроцитов в этом же объеме. Для упрощения расчетов можно разделить содержание гемоглобина, выраженное в г/л, на число эритроцитов в миллионах.
9. Определение среднего объема эритроцитов
Для выяснения наличия микро- и макроцитозов наряду с непосредственным измерением размеров эритроцитов на мазках удобнее вычислять средний объем эритроцитов косвенно, который выражают в кубических микрометрах (мкм3).
9.1. Ход определения и учет результатов.
Для определения среднего объема эритроцитов показания гематокритного числа делят на число эритроцитов в 1 мкл крови.
Практически средний объем эритроцитов определяют по формуле:
А х 1000/Б,
где: А - гематокритное число, л/л; Б - число эритроцитов, млн /мкл.