Бремя гемоглобинопатий можно эффективно облегчить путем установления стратегического баланса между программами ведения и предупреждения болезней.
Ведение серповидноклеточной анемии осуществляется с помощью простых процедур, включая следующие:
· потребление жидкостей в большом количестве;
· здоровое питание;
· добавки фолиевой кислоты;
· медикаментозное лечение боли;
· вакцинация и антибиотики для профилактики и лечения инфекций;
· ряд других терапевтических мер.
При большой талассемии требуются регулярные переливания крови, чтобы поддерживать поступление в организм гемоглобина и сохранять жизнь. В результате многочисленных переливаний органы становятся сильно перегруженными железом, и для ведения этого состояния необходимо специальное лечение. Талассемии можно излечивать с помощью успешной трансплантации костного мозга, но это дорогостоящая процедура, которая трудно доступна во многих местах.
Самая экономически эффективная стратегия уменьшения облегчения бремени гемоглобинопатий состоит в дополнении ведения болезни программами по предупреждению. С помощью недорогих и надежных анализов крови можно выявлять супружеские пары, подвергающиеся риску иметь пораженных этим заболеванием детей. Такой скрининг является особенно уместным перед заключением брака или наступлением беременности, так как он дает возможность супругам обсудить вопросы, связанные со здоровьем их семьи. Во время последующего генетического консультирования носителей характерных генов информируют о рисках передачи болезни их детям, о необходимом лечении в случае, если ребенок будет поражен гемоглобинопатией, и о возможных вариантах для супружеской пары. Дородовый скрининг на генетические заболевания поднимает конкретные этические, юридические и социальные вопросы, которые требуют надлежащего рассмотрения.
Вестерн-блоттинг (вестерн-блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS – додецилсульфат натрия – денатурирующий агент) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку.
Вестерн-блоттинг используется в молекулярной биологии, биохимии, генетике и в других естественно-научных дисциплинах.
Другие сходные методы используют антитела для определения белков в тканях и клетках посредством иммуноокрашивания и иммуноферментного анализа (ИФА, англ. ELISA).
Вестерн-блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (англ. George Stark) в Стэнфорде. Название вестерн-блот было дано технике У. Нейлом Бёрнеттом (англ. W. Neal Burnette)[4] и является игрой слов от названия Саузерн блоттинг, — методики определения ДНК, разработанной ранее Эдвином Саузерном. Аналогичный метод определения РНК называется нозерн блоттингом, детекция посттрансляционных модификаций белков называется истерн блоттингом (англ. Eastern blotting).
Метод Сэнгера
«Секвенирующая лестница», радиоавтограф геля
Метод Сэнгера — метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году[1], за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году.
Принцип метода
В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит:
· праймер — небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, комплементарную началу участка, который нужно отсеквенировать. Праймер необходим потому, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез цепи «с пустого места», они только присоединяют следующий нуклеотид к уже имеющейся 3'-гидроксильной группе предыдущего. Праймер, таким образом, представляет собой «затравку» при синтезе ДНК;
· небольшое количество радиоактивно меченного дезоксинуклеотида (например, [32P]-дАТФ), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции;
· смесь трёх дезоксинуклеотидов в оптимальных для протекания реакции концентрациях, четвёртый дезоксинуклеотид в более низкой концентрации и дидезоксипроизводное четвёртого нуклеотида.
У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3'-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят радиоавтографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК[2][1].
Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции.
Современное состояние[править | править вики-текст]
Графическое представление результатов секвенирования ДНК
На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Использование дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками с разными длинами волн испускания позволяет проводить реакцию в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом в растворе, фрагменты ДНК, выходящие из капиллярной колонки регистрируются детектором флуоресценции. Результаты анализируют с помощью компьютера и представляют в виде последовательности разноцветных пиков, соответствующих четырём нуклеотидам. Секвенаторы такого типа могут «прочитывать» за один раз последовательности длиной 500—1000 нуклеотидов. Для сравнения, метод пиросеквенирования, разработанный в 1996 году, позволяет за один этап определить последовательность значительно меньшего числа нуклеотидов. Автоматизация значительно ускорила процесс секвенирования и позволила осуществить секвенирования целых геномов, включая геном человека[2].
С конца 90-х годов прошлого века в практику начало внедряться секвенирование нового поколения, основанное на принципе «секвенирование посредством синтеза». На современных секвенаторах с использованием такой техники (существует три модификации этой методики – Illumina, Roche 454 и IonTorrent) возможно за один проход секвенировать полный геном человека (то есть за неполную неделю полностью расшифровать последовательность нуклеотидов в генетическом материале конкретного индивида).
=================================================
Сравнительная геномная гибридизация - comparative genome hybridization (CGH).
Небольшие делеции и дупликации отдельных сегментов ДНК (менее 2 мегабаз), невидимые в обычных метафазных препаратах хромосом, — важные дефекты, приводящие к синдромам врожденных пороков и развитию рака. Такие мелкие аберрации в большом числе сегментов ДНК могут быть выявлены благодаря применению другой флюоресцентной техники, сравнительной геномной гибридизации (англ. comparative genome hybridization — CGH). CGH используют для измерения различий в количестве копий между двумя образцами ДНК или дозировки конкретного сегмента ДНК. Одна из быстро развивающихся технологий CGH высокого разрешения называется матричной CGH. При этом методе весь образец ДНК из одного источника (тест) помечают красной флюоресцентной краской, а другой (контрольный) образец — зеленой краской. Два меченных образца ДНК смешивают в равных количествах и проводят гибридизацию с микроматрицей, содержащей до 100 000 и более однонитевых олигонуклеотидов, соответствующих различным уникальным последовательностям генома человека. Уникальные последовательности выбирают так, чтобы они были равномерно распределены (менее чем через 30 килобаз) по всему геному. Соотношение красной и зеленой флюоресценции, излучаемой ДНК, гибридизировавшейся с олигонуклеотидными зондами в каждой позиции, позволяет оценить преобладание конкретного сегмента ДНК, представленного этим олигонуклеотидом, в испытываемом образце по сравнению с контролем. Если ДНК конкретного региона хромосомы представлена одинаково в двух образцах, исследуемых CGH-методом, соотношение красной и зеленой флюоресценции в сигнале будет 1:1. Однако если, например, ДНК нормальной линии клеток помечена зеленым красителем, а ДНК с одной или тремя копиями этого сегмента помечена красным, то соотношение красного и зеленого флюоресцентного сигнала в точке с олигонуклеотидным зондом, соответствующим такой последовательности из мутантной области, сдвинется от 1:1 к 0,5:1 в случае одной копии и к 1,5:1 при наличии трех копий этого участка. CGH-метод особенно полезен для обнаружения изменений в дозе генов в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями того же больного. CGH-матрицы также успешно используют для поиска цитогенетически необнаруживаемых делеций и дупликаций у некоторых пациентов, наблюдаемых в генетических клиниках, с необъяснимыми пороками развития или умственной задержкой при нормальном хромосомном анализе, проведенном стандартным методом. Кроме того, метод CGH позволил обнаружить в популяциях человека ранее недооцененную нормальную вариабельность числа копий определенных сегментов ДНК, известную как количественный полиморфизм.
