The Polymerase Chain Reaction

Kary B. Mullis

Nobel Lecture

Nobel Lecture, December 8, 1993

The Polymerase Chain Reaction

In 1944 Erwin Schroedinger, stimulated intellectually by Max Delbrück, published a little book called What is Life? It was an inspiration to the first of the molecular biologists, and has been, along with Delbrück himself, credited for directing the research during the next decade that solved the mystery of how “like begat like.”

Max was awarded this Prize in 1969, and rejoicing in it, he also lamented that the work for which he was honored before all the peoples of the world was not something which he felt he could share with more than a handful. Samuel Beckett‘s contributions in literature, being honored at the same time, seemed to Max somehow universally accessible to anyone. But not his. In his lecture here Max imagined his imprisonment in an ivory tower of science.

“The books of the great scientists,” he said, “are gathering dust on the shelves of learned libraries. And rightly so. The scientist addresses an infinitesimal audience of fellow composers. His message is not devoid of universality but it’s universality is disembodied and anonymous. While the artist’s communication is linked forever with it’s original form, that of the scientist is modified, amplified, fused with the ideas and results of others, and melts into the stream of knowledge and ideas which forms our culture. The scientist has in common with the artist only this: that he can find no better retreat from the world than his work and also no stronger link with his world than his work.”

Well, I like to listen to the wisdom of Max Delbrück. Like my other historical hero, Richard Feynman, who also passed through here, Max had a way of seeing directly into the core of things and clarifying it for the rest of us.

But I am not convinced with Max that the joy of scientific creation must remain completely mysterious and unexplainable, locked away from all but a few esoterically informed colleagues. I lean toward Feynman in this matter. I think Feynman would have said, if you can understand it, you can explain it.

So I’m going to try to explain how it was that I invented the polymerase chain reaction. There’s a bit of it that will not easily translate into normal language. If that part weren’t of some interest to more than a handful of people here, I would just leave it out. What I will do instead is let you know when we get to that and also when we are done with it. Don’t trouble yourself over it. It’s esoteric and not crucial. I think you can understand what it felt like to invent PCR without following the details.

In 1953, when Jim Watson and Francis Crick published the structure of DNA, Schroedinger’s little book and I were eight years old. I was too young to notice that mankind had finally understood how it might be that “like begat like.” The book had been reprinted three times. I was living in Columbia S.C., where no one noticed that we didn’t have a copy. But my home was a few blocks away from an undeveloped wooded area with a creek, possums, racoons, poisonous snakes, dragons, and a railroad track. We didn’t need a copy. It was a wilderness for me and my brothers, an unknown and unregimented place to grow up. And if we got bored of the earth, we could descend into the network of storm drains under the city. We learned our way around that dark, subterranean labyrinth. It always frightened us. And we always loved it.

Кэри Б. Маллис

Нобелевская лекция

Нобелевская лекция, 8 декабря 1993 г.

Полимеразная цепная реакция

В 1944 году Эрвин Шредингер, интеллектуально вдохновленный Максом Дельбрюком, опубликовал небольшую книгу под названием «Что такое жизнь?». Это было источником вдохновения для первых молекулярных биологов, и, вместе с самим Дельбрюком, ему приписывают руководство исследованиями в течение следующего десятилетия, которые разрешили загадку того, как «подобное рождает подобное».

Макс был удостоен этой премии в 1969 году, и, радуясь этому, он также сетовал на то, что работа, за которую он был удостоен чести перед всеми народами мира, не была чем-то, чем, по его мнению, он мог разделить больше, чем горстку. Литературный вклад Сэмюэля Беккета, который в то же время был отмечен, Максу каким-то образом казался универсально доступным для всех. Но не его. В своей лекции Макс представил свое заточение в башне науки из слоновой кости.

«Книги великих ученых, - сказал он, - пылятся на полках научных библиотек. И это правильно. Ученый обращается к бесконечно малой аудитории коллег-композиторов. Его послание не лишено универсальности, но оно бесплотно и анонимно. В то время как коммуникация художника навсегда связана с ее первоначальной формой, коммуникация ученого видоизменяется, усиливается, сливается с идеями и результатами других и растворяется в потоке знаний и идей, который формирует нашу культуру. Ученый объединяет с художником только то, что он не может найти лучшего уединения от мира, чем его работа, а также нет более сильной связи со своим миром, чем его работа ».

Что ж, мне нравится слушать мудрость Макса Дельбрюка. Как и другой мой исторический герой, Ричард Фейнман, который тоже прошел здесь, Макс умел заглядывать прямо в суть вещей и прояснять ее для всех нас.

Но я не убежден вместе с Максом в том, что радость научного творчества должна оставаться полностью таинственной и необъяснимой, недоступной для всех, кроме нескольких эзотерически осведомленных коллег. В этом вопросе я склоняюсь к Фейнману. Я думаю, Фейнман сказал бы: «Если вы это понимаете, вы можете объяснить это».

Итак, я попытаюсь объяснить, как я изобрел полимеразную цепную реакцию. Есть кое-что, что нелегко перевести на нормальный язык. Если бы эта часть не интересовала больше, чем горстку людей, я бы просто пропустил ее. Вместо этого я дам вам знать, когда мы доберемся до этого, а также когда мы закончим с этим. Не беспокойтесь об этом. Это эзотерично и не критично. Думаю, вы можете понять, что значит изобрести ПЦР, не вдаваясь в подробности.

В 1953 году, когда Джим Уотсон и Фрэнсис Крик опубликовали структуру ДНК, мне и маленькой книжке Шредингера было восемь лет. Я был слишком молод, чтобы заметить, что человечество, наконец, поняло, как могло быть такое «подобное родилось подобное». Книга переиздавалась трижды. Я жил в Колумбии, Южная Каролина, где никто не заметил, что у нас нет копии. Но мой дом находился в нескольких кварталах от неосвоенной лесной местности с ручьем, опоссумами, енотами, ядовитыми змеями, драконами и железнодорожными путями. Копия нам не нужна. Для меня и моих братьев это была пустыня, неизведанное и неуправляемое место, где можно было расти. А если бы нам наскучила земля, мы могли бы спуститься в сеть ливневых стоков под городом. Мы научились обходить этот темный подземный лабиринт. Это всегда пугало нас. И нам всегда это нравилось.

By the time Watson and Crick were being honored here in Stockholm in 1962, I had been designing rockets with my adolescent companions for three years. For fuel, we discovered that a mixture of potassium nitrate and sugar could be very carefully melted over a charcoal stove and poured into a metal tube in a particular way with remarkable results. The tube grew larger with our successive experiments until it was about four feet long. My mother grew more cautious and often her head would appear out of an upstairs window and she would say things that were not encouraging. The sugar was reluctantly furnished from her own kitchen, and the potassium nitrate we purchased from the local druggist.

Back then in South Carolina young boys seeking chemicals were not immediately suspect. We could even buy dynamite fuse from the hardware with no questions asked. This was good, because we were spared from early extinction on one occasion when our rocket exploded on the launch pad, by the very reliable, slowly burning dynamite fuses we could employ, coupled with our ability to run like the wind once the fuse had been lit. Our fuses were in fact much improved over those which Alfred Nobel must have used when he was frightening his own mother. In one of our last experiments before we became so interested in the maturing young women around us that we would not think deeply about rocket fuels for another ten years, we blasted a frog a mile into the air and got him back alive. In another, we inadvertently frightened an airline pilot, who was preparing to land a DC-3 at Columbia airport. Our mistake.

At Dreher High School, we were allowed free, unsupervised access to the chemistry lab. We spent many an afternoon there tinkering. No one got hurt and no lawsuits resulted. They wouldn’t let us in there now. Today, we would be thought of as a menace to society. If I’m not mistaken, Alfred Nobel for a time was not allowed to practice his black art on Swedish soil. Sweden, of course, was then and still is a bit ahead of the United States in these matters.

I never tired of tinkering in labs. During the summer breaks from Georgia Tech, Al Montgomery and I built an organic synthesis lab in an old chicken house on the edge of town where we made research chemicals to sell. Most of them were noxious or either explosive. No one else wanted to make them, somebody wanted them, and so their production became our domain. We suffered no boredom and no boss. We made enough money to buy new equipment. Max Gergel, who ran Columbia Organic Chemicals Company, and who was an unusually nice man, encouraged us and bought most of our products, which he resold. There were no government regulators to stifle our fledgling efforts, and it was a golden age, but we didn’t notice it. We learned a lot of organic chemistry.

By the time I left Georgia Tech for graduate school in biochemistry at the University of California at Berkeley, the genetic code had been solved. DNA did not yet interest me. I was excited by molecules. DNA before PCR was long and stringy, not really molecular at all. Six years in the biochemistry department didn’t change my mind about DNA, but six years of Berkeley changed my mind about almost everything else.

К тому времени, когда в 1962 году здесь, в Стокгольме, чествовали Ватсона и Крика, я уже три года разрабатывал ракеты со своими товарищами-подростками. В качестве топлива мы обнаружили, что смесь нитрата калия и сахара можно очень осторожно растопить на угольной плите и особым образом перелить в металлическую трубку с замечательными результатами. В ходе наших последовательных экспериментов трубка увеличивалась, пока не достигла примерно четырех футов в длину. Моя мать стала более осторожной, и часто ее голова показывалась из окна наверху, и она говорила вещи, которые не обнадеживали. Сахар нехотя доставляли из ее собственной кухни, а нитрат калия мы купили у местного аптекаря.

Тогда в Южной Каролине мальчики, ищущие химикаты, не сразу вызывали подозрение. Мы даже могли купить динамитный взрыватель прямо из оборудования, не задавая вопросов. Это было хорошо, потому что в одном случае, когда наша ракета взорвалась на стартовой площадке, мы были избавлены от преждевременного вымирания благодаря очень надежным, медленно горящим динамитным взрывателям, которые мы могли использовать, в сочетании с нашей способностью бежать со скоростью ветра, когда взрыватель был горит Фактически наши предохранители были намного лучше тех, которые, должно быть, использовал Альфред Нобель, когда пугал свою собственную мать. В одном из наших последних экспериментов, прежде чем мы настолько заинтересовались взрослеющими молодыми женщинами вокруг нас, что мы не задумывались о ракетном топливе еще десять лет, мы взорвали лягушку на милю в воздух и вернули ее живым. В другом мы непреднамеренно напугали пилота авиакомпании, который готовился к посадке DC-3 в аэропорту Колумбии. Наша ошибка.

В средней школе Дреер нам разрешили бесплатный неконтролируемый доступ в химическую лабораторию. Мы провели там много времени, возясь. Никто не пострадал, и судебных исков не было. Нас бы сейчас туда не пустили. Сегодня нас будут считать угрозой для общества. Если я не ошибаюсь, Альфреду Нобелю какое-то время не разрешалось практиковать свое черное искусство на шведской земле. Швеция, конечно, тогда была и остается немного впереди США в этих вопросах.

Я никогда не уставал возиться в лабораториях. Во время летних каникул в Технологическом институте Джорджии Эл Монтгомери и я построили лабораторию органического синтеза в старом птичнике на окраине города, где мы производили исследовательские химикаты для продажи. Большинство из них были ядовитыми или взрывоопасными. Никто другой не хотел их производить, кто-то их хотел, и поэтому их производство стало нашей сферой. У нас не было ни скуки, ни начальника. Мы заработали достаточно денег, чтобы купить новое оборудование. Макс Гергель, который руководил Columbia Organic Chemicals Company и был необычайно приятным человеком, поддерживал нас и покупал большую часть нашей продукции, которую он перепродавал. Не существовало государственных регулирующих органов, которые могли бы подавить наши молодые усилия, и это был золотой век, но мы этого не заметили. Мы узнали много об органической химии.

К тому времени, когда я бросил Технологический институт Джорджии и поступил в аспирантуру по биохимии в Калифорнийском университете в Беркли, генетический код был разгадан. ДНК меня пока не интересовала. Меня возбуждали молекулы. ДНК до ПЦР была длинной и волокнистой, совсем не молекулярной. Шесть лет на кафедре биохимии не изменили мое мнение о ДНК, но шесть лет в Беркли изменили мое мнение почти обо всем остальном.

I was in the laboratory of Joe Neilands who provided his graduate students with a place to work and very few rules. I’m not even sure that Joe knew any rules except the high moral ground of social responsibility and tolerance. Not knowing that the department did have rules, I took astrophysics courses instead of molecular biology, which I figured I could learn from my molecular biologist friends. I published my first scientific paper in Nature, in 1968. It was a sophomoric astrophysical hypothesis called “The Cosmological Significance of Time Reversal.” I think Nature is still embarrassed about publishing it, but it was immensely useful to me when it came time for my qualifying examination. The committee would decide whether or not I would be allowed to take a Ph. D, without having taken molecular biology. And my paper in Nature, helped them to justify a “yes.” In retrospect, the membership of that committee is intriguing.

Don Glaser, who received this Prize in physics in 1960 at age 34, would later be one of the founders of Cetus Corporation, where I was working when I invented PCR. Henry Rapaport, who discovered psoralens would be the scientific advisor to my department at Cetus, and would co-author two patents with me. Alan Wilson, now sadly passed away, would be the first researcher outside of Cetus to employ PCR. And Dan Koshland would be the editor of Science when my first PCR paper was rejected from that journal and also the editor when PCR was three years later proclaimed Molecule of the Year. I passed. None of us, I think, as we walked out of that room, had any conscious inkling of the way things would turn out among us.

In Berkeley it was a time of social upheaval and Joe Neilands was the perfect mentor to see his people through it with grace. We laughed a lot over tea at four every afternoon around a teakwood table that Joe had brought from home and oiled once a month. Our lab had an ambience that was special. I decided to become a neurochemist. Joe was the master of microbial iron transport molecules. It wasn’t done like that in most labs, where the head of the lab would prefer that you help advance his career by elaborating on some of his work. Not so with Neilands. As long as I wrote a thesis and got a degree, he didn’t care what else I did, and I stayed in his lab happily, following my own curiosity even if it carried me into music courses, for as long as Joe thought we could get away with it. The department was paying me a monthly stipend from the NIH, and eventually, Joe knew, I would have to leave.

After six years I headed east with a Ph. D. and confidence in my education. My wife of a few months went to Kansas to go to medical school and I followed her there. That was 1972.

I had made no professional plans that would work in Kansas, so I decided to become a writer. I discovered pretty quickly that I was far too young. I didn’t know anything yet about tragedy, and my characters were flat. I didn’t know how to describe a mean spririt in terms someone else could believe.

So I had to get a job as a scientist. I found one at the medical school working with two pediatric cardiologists and a pathologist. It was a very fortunate accident. For one thing pediatricians are always the nicest doctors, and for another thing these doctors were very special: Leone Mattioli, whose wife could cook, Agostino Molteni and Richard Zakheim. For two years I did medical research, learned how to appreciate Old World values from two Italians and a New York Jew, and learned human biology for the first time.

Marriage over, I returned to Berkeley, working for a time in a restaurant and then at the University of California at San Francisco killing rats for their brains. I saw Max Delbrück talk, but I don’t think I understood the significance of who he was, nor was I influenced to go into molecular biology by him. I was working on the enkephalins.

Я был в лаборатории Джо Нейландса, который предоставил своим аспирантам место для работы и очень мало правил. Я даже не уверен, что Джо знал какие-либо правила, кроме высоких моральных основ социальной ответственности и толерантности. Не зная, что на кафедре есть правила, я пошел на курсы астрофизики вместо молекулярной биологии, которую, как я полагал, мог бы изучить у моих друзей-молекулярных биологов. Я опубликовал свою первую научную статью в журнале Nature в 1968 году. Это была изощренная астрофизическая гипотеза под названием «Космологическое значение обращения времени». Я думаю, что Nature до сих пор стесняется опубликовать его, но он был мне чрезвычайно полезен, когда пришло время сдавать квалификационный экзамен. Комитет решал, разрешат ли мне получить степень доктора философии без изучения молекулярной биологии. И моя статья в Nature помогла им оправдать свое «да». Оглядываясь назад, можно сказать, что состав этого комитета интригует.

Дон Глейзер, получивший эту премию по физике в 1960 году в возрасте 34 лет, позже станет одним из основателей Cetus Corporation, где я работал, когда изобрел ПЦР. Генри Рапапорт, открывший псоралены, будет научным консультантом моего отдела в Cetus и будет соавтором двух патентов вместе со мной. Алан Уилсон, к сожалению, скончавшийся, станет первым исследователем за пределами Cetus, который применит ПЦР. А Дэн Кошланд стал редактором журнала Science, когда моя первая статья о PCR была отклонена из этого журнала, а также редактором, когда три года спустя PCR была объявлена ​​молекулой года. Я прошел. Думаю, никто из нас, выходя из этой комнаты, не имел никакого сознательного представления о том, как все обернется среди нас.

В Беркли это было время социальных потрясений, и Джо Нейландс был идеальным наставником, который помогал своим людям справиться с этим с изяществом. Мы много смеялись за чаем в четыре часа дня за столом из тикового дерева, который Джо приносил из дома и смазывал маслом раз в месяц. В нашей лаборатории была особенная атмосфера. Я решил стать нейрохимиком. Джо был мастером микробных транспортных молекул железа. В большинстве лабораторий этого не делали, и руководитель лаборатории предпочел бы, чтобы вы помогли ему продвинуться по карьерной лестнице, доработав некоторые из его работ. Не так с Нейландсом. Пока я писал диссертацию и получил степень, ему было все равно, чем я еще занимался, и я с радостью оставался в его лаборатории, следуя собственному любопытству, даже если оно приводило меня к музыкальным курсам, пока Джо считал, что мы может сойти с рук. Департамент выплачивал мне ежемесячную стипендию от Национального института здоровья, и в конце концов, Джо знал, что мне придется уйти.

Через шесть лет я отправился на восток со степенью доктора философии и уверенностью в своем образовании. Моя жена на несколько месяцев поехала в Канзас, чтобы поступить в медицинскую школу, и я последовал за ней туда. Это был 1972 год.

У меня не было профессиональных планов по работе в Канзасе, поэтому я решил стать писателем. Я довольно быстро обнаружил, что я слишком молод. Я еще ничего не знал о трагедии, а мои персонажи были плоскими. Я не знала, как описать подлый дух словами, в которые может поверить кто-то другой.

Так что мне пришлось устроиться на работу ученым. Я нашла одного в медицинской школе, где работали два детских кардиолога и патолог. Это была очень удачная авария. Во-первых, педиатры всегда самые хорошие врачи, а во-вторых, эти врачи были особенными: Леоне Маттиоли, жена которого умела готовить, Агостино Молтени и Ричард Закхейм. В течение двух лет я проводил медицинские исследования, научился ценить ценности Старого Света от двух итальянцев и еврея из Нью-Йорка и впервые изучил биологию человека.

После женитьбы я вернулся в Беркли, поработав какое-то время в ресторане, а затем в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, убивая крыс ради мозга. Я видел, как говорил Макс Дельбрюк, но не думаю, что я понимал значение того, кем он был, и при этом он не повлиял на меня, чтобы заняться молекулярной биологией. Я работал над энкефалинами.

But then there was a seminar describing the synthesis and cloning of a gene for somatostatin. That impressed me. For the first time I realized that significant pieces of DNA could be synthesized chemically and that they were likely to be very exciting. I started studying DNA synthesis in the library. And I started looking for a job making DNA molecules.

Cetus hired me in the fall of 1979. I worked long hours and enjoyed it immensely. DNA synthesis was much more fun than killing rats, and the San Francisco Bay Area was a good place to be doing it. There were a number of biotechnology companies and several academic groups working on improving the synthesis methods for DNA. Within two years, there was a machine in my lab from Biosearch of San Rafael, California, turning out oligonucleotides much faster than the molecular biologists at Cetus could use them. I started playing with the oligonucleotides to find out what they could do.

The lab next door to me was run by Henry Erlich and was working on methods for detecting point mutations. We had made a number of oligonucleotides for them. I started thinking about their problem and proposed an idea of my own which they ended up calling oligomer restriction. It worked as long as the target sequence was fairly concentrated, like a site on a purified plasmid, but it didn’t work if the site was relatively rare, like a single copy gene in human DNA.

I apologize to those of you who just got lost, but I do have to say a few things now that are going to be difficult. I will get back to the story in a few minutes.

The oligomer restriction method also relied on the fact that the target of interest contained a restriction site polymorphism, which kept it from being universally applicable to just any point mutation. I started thinking about doing some experiments wherein an oligonucleotide hybridized to a specific site could be extended by DNA polymerase in the presence of only dideoxynucleoside triphosphates. I reasoned that if one of the dideoxynucleoside triphosphates in each of four aliquots of a reaction was radioactive then a analysis of the aliquots on a gel could indicate which of the dideozynucleoside triphosphates had added to the hybridized oligonucleotide and therefore which base was adjacent to the three prime end of the oligonucleotide. It would be like doing Sanger sequencing at a single base pair.

On human DNA, it would not have worked because the oligonucleotide would not have specifically bound to a single site. On a DNA as complex as human DNA it would have bound to hundreds or thousands of sites depending on the sequence involved and the conditions used. What I needed to make this work was some method of raising the relative concentration of the specific site of interest. What I needed was PCR, but I had not considered that possibility. I knew the difference numerically between five thousand base pairs as in a plasmid and three billion base pairs as in the human genome, but somehow it didn’t strike me as sharply as it should have. My ignorance served me well. I kept on thinking about my experiment without realizing that it would never work. And it turned into PCR.

Но потом был семинар по синтезу и клонированию гена соматостатина. Это меня впечатлило. Впервые я понял, что значительные фрагменты ДНК могут быть синтезированы химическим путем, и что они, вероятно, будут очень интересными. Я начал изучать синтез ДНК в библиотеке. И я начал искать работу по созданию молекул ДНК.

Cetus нанял меня осенью 1979 года. Я работал много часов и получал огромное удовольствие. Синтез ДНК был намного веселее, чем убийство крыс, и район залива Сан-Франциско был подходящим местом для этого. Над улучшением методов синтеза ДНК работали несколько биотехнологических компаний и несколько академических групп. Через два года в моей лаборатории появилась машина из Biosearch в Сан-Рафаэле, Калифорния, которая производила олигонуклеотиды намного быстрее, чем могли их использовать молекулярные биологи из Cetus. Я начал играть с олигонуклеотидами, чтобы узнать, на что они способны.

Лабораторией по соседству со мной руководил Генри Эрлих, и она работала над методами обнаружения точечных мутаций. Мы сделали для них ряд олигонуклеотидов. Я начал думать об их проблеме и предложил свою идею, которую они в итоге назвали ограничением олигомеров. Это работало до тех пор, пока целевая последовательность была достаточно концентрированной, как сайт на очищенной плазмиде, но не работала, если сайт был относительно редким, как ген с единственной копией в ДНК человека.

Я прошу прощения у тех из вас, кто только что заблудился, но сейчас я должен сказать несколько вещей, которые будут трудными. Я вернусь к истории через несколько минут.

Метод рестрикции олигомеров также основывается на том факте, что интересующая мишень содержит полиморфизм сайта рестрикции, что препятствует его универсальному применению к любой точечной мутации. Я начал думать о проведении некоторых экспериментов, в которых олигонуклеотид, гибридизованный с определенным сайтом, мог бы быть расширен ДНК-полимеразой в присутствии только дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Я рассудил, что если один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов в каждой из четырех аликвот реакции был радиоактивным, то анализ аликвот в геле мог указать, какой из дидезозинуклеозидтрифосфатов был добавлен к гибридизованному олигонуклеотиду и, следовательно, какое основание было рядом с тремя первичный конец олигонуклеотида. Это было бы похоже на секвенирование по Сэнгеру для одной пары оснований.

На ДНК человека это не сработало бы, потому что олигонуклеотид не мог бы специфически связываться с одним сайтом. В такой сложной ДНК, как ДНК человека, она могла бы связываться с сотнями или тысячами сайтов, в зависимости от задействованной последовательности и используемых условий. Для выполнения этой работы мне нужен был какой-то метод повышения относительной концентрации конкретного интересующего участка. Мне была нужна ПЦР, но я не рассматривал эту возможность. Я знал числовую разницу между пятью тысячами пар оснований, как в плазмиде, и тремя миллиардами пар оснований, как в геноме человека, но почему-то это не поразило меня так резко, как должно было быть. Мое невежество сослужило мне хорошую службу. Я продолжал думать о своем эксперименте, не понимая, что он никогда не сработает. И это превратилось в ПЦР.

One Friday night I was driving, as was my custom, from Berkeley up to Mendocino where I had a cabin far away from everything off in the woods. My girlfriend, Jennifer Barnett, was asleep. I was thinking. Since oligonucleotides were not that hard to make anymore, wouldn’t it be simple enough to put two of them into the reaction instead of only one such that one of them would bind to the upper strand and the other to the lower strand with their three prime ends adjacent to the opposing bases of the base pair in question. If one were made longer than the other then their single base extension products could be separated on a gel from each other and one could act as a control for the other. I was going to have to separate them on a gel anyway from the large excess of radioactive nucleosidetriphosphate. What I would hope to see is that one of them would pick up one radioactive nucleotide and the other would pick up its complement. Other combinations would indicate that something had gone wrong. It was not a perfect control, but it would not require a lot of effort. It was about to lead me to PCR.

I liked the idea of a control that was nearly free in terms of cost and effort. And also, it would help use up the oligonucleotides that my lab could now make faster than they could be used.

As I drove through the mountains that night, the stalks of the California buckeyes heavily in blossom leaned over into the road. The air was moist and cool and filled with their heady aroma.

Encouraged by my progress on the thought experiment I continued to think about it and about things that could possibly go wrong. What if there were deoxynucleoside triphosphates in the DNA sample, for instance? What would happen? What would happen, I reasoned, is that one or more of them would be added to the oligonucleotide by the polymerase prior to the termination of chain elongation by addition of the dideoxynucleoside triphosphate, and it could easily be the wrong dideoxynucleoside triphosphate and it surely would result in an extension product that would be the wrong size, and the results would be spurious. It would not do. I needed a way to insure that the sample was free from contamination from deoxynucleoside triphosphates. I could treat the sample before the extension reaction with bacterial alkaline phosphatase. The enzyme would degrade any triphosphates present down to nucleosides which would not interfere with the main reaction, but then I would need to “deactivate the phosphatase before adding the dideoxynucleoside triphosphates and everyone knew at that time that BAP, as we called it, was not irreversibly denaturable by heat. The reason we knew this was that the renaturation of heat denatured BAP had been demonstrated in classic experiments that had shown that a protein’s shape was dictated by it’s sequence. In the classical experiments the renaturation had been performed in a buffer containing lots of zinc. What had not occurred to me or apparently many others was that BAP could be irreversibly denatured if zinc was omitted from the buffer, and that zinc was not necessary in the buffer if the enzyme was only going to be used for a short time and had its own tightly bound zinc to begin with. There was a product on the market at the time called matBAP wherein the enzyme was attached to an insoluble matrix which could be filtered out of a solution after it had been used. The product sold because people were of the impression that you could not irreversibly denature BAP. We’d all heard about, but not read, the classic papers.

Однажды вечером в пятницу я ехал по своему обыкновению из Беркли в Мендосино, где у меня была хижина вдали от всего, что находится в лесу. Моя девушка, Дженнифер Барнетт, спала. Я подумал. Поскольку олигонуклеотиды больше не было так сложно производить, не было бы достаточно просто ввести в реакцию два из них вместо одного, так что один из них будет связываться с верхней цепью, а другой - с нижней цепью своими тремя? простые концы, смежные с противоположными основаниями рассматриваемой пары оснований. Если бы один был сделан длиннее другого, то их единственные продукты удлинения основы можно было бы отделить на геле друг от друга, и один мог бы действовать как контроль для другого. Мне все равно пришлось отделить их на геле от большого избытка радиоактивного нуклеозидтрифосфата. Я надеюсь увидеть, что один из них подхватит один радиоактивный нуклеотид, а другой подберет его дополнение. Другие комбинации указывают на то, что что-то пошло не так. Это был не идеальный контроль, но для этого не потребовалось бы много усилий. Это должно было привести меня к ПЦР.

Мне понравилась идея управления, которое было почти бесплатным с точки зрения затрат и усилий. Кроме того, это поможет израсходовать олигонуклеотиды, которые моя лаборатория теперь может производить быстрее, чем они могут быть использованы.

В ту ночь, когда я ехал через горы, стебли калифорнийских баккей, густо цветущих, наклонились к дороге. Воздух был влажным и прохладным, наполненным их пьянящим ароматом.

Ободренный своим прогрессом в мысленном эксперименте, я продолжал думать об этом и о вещах, которые могли пойти не так. Что, если бы, например, в образце ДНК были дезоксинуклеозидтрифосфаты? Что случилось бы? Я рассудил, что может произойти то, что один или несколько из них будут добавлены к олигонуклеотиду полимеразой до завершения удлинения цепи добавлением дидезоксинуклеозидтрифосфата, и это может легко оказаться неправильный дидезоксинуклеозидтрифосфат, и это наверняка приведет к получению удлинительного продукта неправильного размера, и результаты будут ложными. Это не годится. Мне нужен был способ убедиться, что образец не загрязнен дезоксинуклеозидтрифосфатами. Я мог обработать образец до реакции удлинения бактериальной щелочной фосфатазой. Фермент будет разлагать любые присутствующие трифосфаты до нуклеозидов, которые не будут мешать основной реакции, но тогда мне нужно было бы «дезактивировать фосфатазу перед добавлением дидезоксинуклеозидтрифосфатов, и все знали в то время, что BAP, как мы его называли, не был необратимо денатурируется теплом. Причина, по которой мы знали это, заключалась в том, что ренатурация теплового денатурированного БАТ была продемонстрирована в классических экспериментах, которые показали, что форма белка определяется его последовательностью. В классических экспериментах ренатурацию проводили в буфере, содержащем много цинка. Что не приходило мне в голову или, по-видимому, многим другим, так это то, что БАТ может быть необратимо денатурирован, если цинк не был включен в буфер, и что цинк не был необходим в буфере, если фермент собирался использовать только в течение короткого времени и имел свой собственный прочно связанный цинк. В то время на рынке был продукт под названием matBAP, в котором фермент был присоединен к нерастворимой матрице, которую можно было отфильтровать из раствора после его использования. Продукт продавался, потому что у людей сложилось впечатление, что невозможно безвозвратно денатурировать БАТ. Мы все слышали о классических газетах, но не читали.

This says something about the arbitrary way that many scientific facts get established, but for this story, it’s only importance is that, had I known then that BAP could be heat denatured irreversibly, I may have missed PCR. As it was, I decided against using BAP, and tried to think of another way to get rid of deoxynucleoside triphosphates. How about this, I thought? What if I leave out the radioactive dideoxynucleoside triphosphates, mix the DNA sample with the oligonucleotides, drop in the polymerase and wait? The polymerase should use up all the deoxynucleoside triphosphates by adding them to the hybridized oligonucleotides. After this was complete I could heat the mixture, causing the extended oligonucleotides to be removed from the target, then cool the mixture allowing new, unextended oligonucleotides to hybridize. The extended oligonucleotides would be far outnum- bered by the vast excess of unextended oligonucleotides and therefore would not rehybridize to the target to any great extent. Then I would add the dideoxynucleoside triphosphate mixtures, and another aliquot of polymerase. And now things would work.

But what if the oligonucleotides in the original extension reaction had been extended so far they could now hybridize to unextended oligonucleotides of the opposite polarity in this second round. The sequence which they had been extended into would permit that. What would happen?

EUREKA!!!! The result would be exactly the same only the signal strength would be doubled.

EUREKA again!!!! I could do it intentionally, adding my own deoxynucleoside triphosphates, which were quite soluble in water and legal in California.

And again, EUREKA!!!! I could do it over and over again. Every time I did it I would double the signal. For those of you who got lost, we’re back! I stopped the car at mile marker 46,7 on Highway 128. In the glove compartment I found some paper and a pen. I confirmed that two to the tenth power was about a thousand and that two to the twentieth power was about a million, and that two to the thirtieth power was around a billion, close to the number of base pairs in the human genome. Once I had cycled this reaction thirty times I would be able to the sequence of a sample with an immense signal and almost no background.

Jennifer wanted to get moving. I drove on down the road. In about a mile it occurred to me that the oligonucleotides could be placed at some arbitrary distance from each other, not just flanking a base pair and that I could make an arbitrarily large number of copies of any sequence I chose and what’s more, most of the copies after a few cycles would be the same size. That size would be up to me. They would look like restriction fragments on a gel. I stopped the car again.

“Dear Thor!,” I exclaimed. I had solved the most annoying problems in DNA chemistry in a single lightening bolt. Abundance and distinction. With two oligonucleotides, DNA polymerase, and the four nucleosidetriphosphates I could make as much of a DNA sequence as I wanted and I could make it on a fragment of a specific size that I could distinguish easily. Somehow, I thought, it had to be an illusion. Otherwise it would change DNA chemistry forever. Otherwise it would make me famous. It was too easy. Someone else would have done it and I would surely have heard of it. We would be doing it all the time. What was I failing to see? “Jennifer, wake up. I’ve thought of something incredible.”

She wouldn’t wake up. I had thought of incredible things before that somehow lost some of their sheen in the light of day. This one could wait till morning. But I didn’t sleep that night. We got to my cabin and I starting drawing little diagrams on every horizontal surface that would take pen, pencil or crayon until dawn, when with the aid of a last bottle of good Mendocino county cabernet, I settled into a perplexed semiconsciousness.

Afternoon came, including new bottles of celebratory red fluids from Jack’s Valley Store, but I was still puzzled, alternating between being absolutely pleased with my good luck and clever brain, and being mildly annoyed at myself and Jennifer Barnett, for not seeing the flaw that must have been there. I had no phone at the cabin and there were no other biochemists besides Jennifer and me in Anderson Valley. The conundrum which lingered throughout the week-end and created an unprecedented desire in me to return to work early was compelling. If the cyclic reactions which by now were symbolized in various ways all over the cabin really worked, why had I never heard of them being used? If they had been used, I surely would have heard about it and so would everybody else including Jennifer, who was presently sunning herself by the pond taking no interest in the explosions that were rocking my brain.

Why wouldn’t these reactions work?

Это кое-что говорит о произвольном способе установления многих научных фактов, но для этой истории важно только то, что, если бы я тогда знал, что БАТ может быть необратимо денатурирован нагреванием, я, возможно, пропустил ПЦР. На самом деле я решил не использовать БАП и попытался придумать другой способ избавиться от дезоксинуклеозидтрифосфатов. Как насчет этого, подумал я? Что, если я оставлю радиоактивные дидезоксинуклеозидтрифосфаты, смешаю образец ДНК с олигонуклеотидами, добавлю полимеразу и подожду? Полимераза должна использовать все дезоксинуклеозидтрифосфаты, добавляя их к гибридизированным олигонуклеотидам. После того, как это было завершено, я мог нагреть смесь, что привело к удалению удлиненных олигонуклеотидов из мишени, а затем охладить смесь, позволяя новым, нерастянутым олигонуклеотидам гибридизоваться. Удлиненных олигонуклеотидов будет намного меньше, чем у огромного избытка нерастянутых олигонуклеотидов, и поэтому они не будут повторно гибридизоваться с мишенью в какой-либо значительной степени. Затем я добавил смеси дидезоксинуклеозидтрифосфата и еще одну аликвоту полимеразы. И теперь все будет работать.

Но что, если бы олигонуклеотиды в исходной реакции удлинения были удлинены до такой степени, что теперь они могли бы гибридизоваться с нерасширенными олигонуклеотидами противоположной полярности во втором цикле. Последовательность, в которую они были расширены, позволяла это. Что случилось бы?

ЭВРИКА!!!! Результат будет точно таким же, только мощность сигнала увеличится вдвое.

И снова ЭВРИКА!!!! Я мог сделать это намеренно, добавив собственные дезоксинуклеозидтрифосфаты, которые были достаточно растворимы в воде и разрешены в Калифорнии.

И снова ЭВРИКА!!!! Я мог делать это снова и снова. Каждый раз, когда я это делал, я удваивал сигнал. Для тех из вас, кто заблудился, мы вернулись! Я остановил машину на отметке 46,7 мили на шоссе 128. В бардачке я нашел бумагу и ручку. Я подтвердил, что два в десятой степени равны примерно тысяче, два в двадцатой степени - примерно миллиону, и что два в тридцатой степени составляют примерно миллиард, что близко к числу пар оснований в геноме человека. Выполнив эту реакцию тридцать раз, я смогу отследить последовательность образца с мощным сигналом и почти без фона.

Дженнифер хотела двинуться с места. Я поехал дальше по дороге. Примерно через милю мне пришло в голову, что олигонуклеотиды могут быть размещены на некотором произвольном расстоянии друг от друга, а не просто фланкировать пару оснований, и что я могу сделать произвольно большое количество копий любой выбранной последовательности, и, более того, большую часть копии после нескольких циклов будут одинакового размера. Этот размер мне подходит. Они будут выглядеть как рестрикционные фрагменты на геле. Я снова остановил машину.

«Дорогой Тор!» - воскликнул я. Я решил самые досадные проблемы химии ДНК с помощью одной молнии. Изобилие и различие. С двумя олигонуклеотидами, ДНК-полимеразой и четырьмя нуклеозидтрифосфатами я мог сделать столько последовательности ДНК, сколько хотел, и я мог сделать это на фрагменте определенного размера, который я мог легко различить. Каким-то образом, подумал я, это должна быть иллюзия. В противном случае это навсегда изменило бы химию ДНК. В противном случае это сделало бы меня известным. Это было слишком просто. Кто-то другой сделал бы это, и я наверняка слышал об этом. Мы будем делать это все время. Чего я не видел? «Дженнифер, проснись. Я придумал кое-что невероятное ».

Она не проснется. Раньше я думал о невероятных вещах, которые каким-то образом утратили свой блеск при дневном свете. Это можно подождать до утра. Но в ту ночь я не спал. Мы добрались до моей каюты, и я начал рисовать маленькие диаграммы на каждой горизонтальной поверхности, используя ручку, карандаш или мелок, до рассвета, когда с помощью последней бутылки хорошего каберне округа Мендосино я погрузился в растерянное полусознание.

Наступил полдень, в том числе новые бутылки праздничных красных жидкостей из магазина Jack's Valley, но я все еще был озадачен, чередуя то, что я был абсолютно доволен своей удачей и умным умом, и слегка раздражался на себя и Дженнифер Барнетт за то, что я не видел недостатка, который должно быть там было. У меня не было телефона в хижине, и кроме меня и Дженнифер в Андерсон-Вэлли не было других биохимиков. Загадка, которая сохранялась в течение выходных и вызывала во мне беспрецедентное желание вернуться на работу пораньше, была непреодолимой. Если циклические реакции, которые к настоящему времени по-разному символизировались по всей каюте, действительно работали, почему я никогда не слышал о том, чтобы они использовались? Если бы они использовались, я бы наверняка слышал об этом, и все остальные, включая Дженнифер, которая сейчас загорала у пруда, не интересовалась взрывами, потрясшими мой мозг.

Почему эти реакции не работают?

Monday morning I was in the library. The moment of truth. By afternoon it was clear. For whatever reasons, there was nothing in the abstracted literature about succeeding or failing to amplify DNA by the repeated reciprocal extension of two primers hybridized to the separate strands of a particular DNA sequence. By the end of the week I had talked to enough molecular biologists to know that I wasn’t missing anything really obvious. No one could recall such a process ever being tried.