Инженерная энзимология.
Промышленное производство и применение ферментов.
Роль и значение ферментов
Ферменты, или энзимы, — это биологические катализаторы, обладающие способностью избирательно катализировать многие химические превращения как в живой клетке, так и вне организма. Еще русский физиолог И.П. Павлов называл их истинными двигателями всех природных процессов.
Ферменты нетоксичны, работают при нормальных условиях, обладают высокой специфичностью и эффективностью действия, сохраняют свои свойства вне клетки. Все это позволяет применять их в качестве экологически чистых и недорогих биокатализаторов для технологических процессов в химической, текстильной, кожевенной, пищевой, сельскохозяйственной и других отраслях промышленности.
Значительна роль ферментов в фармакологии и медицине (рис. 7.1). Их широко используют в заместительной терапии при лечении большого числа заболеваний. Так, амилазы, липазы, пепсин, трипсин и химотрипсин (в виде ферментных препаратов и их смесей — фестал, панзинорм, мезим и др.) применяют для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и печени; протеазы — для лечения злокачественных новообразований; плазмин (фибриноли-зин), стрептокиназу, урокиназу — для растворения тромбов в кровеносных сосудах; (3-галактозидазу — для восстановления способности к усвоению молочных продуктов у людей, страдающих недостаточностью этого фермента в желудочно-кишечном тракте. Эластаза задерживает развитие атеросклероза.
Изменение уровня активности определенного фермента или соотношения его множественных форм и изоферментов позволяет проводить диагностику заболевания того или иного органа (энзимодиагностика). Например, повышение в сыворотке крови активности фруктозо-1,6-дифосфатальдо-лазы свидетельствует об инфекционном гепатите, раке печени, инфаркте миокарда; повышение в плазме крови активности креатинкиназы — о мышечной дистрофии, а возрастание активности аланинаминотрансферазы — о болезнях печени и т. д.
|
|
Ферменты применяют при создании новых технологий очистки сточных вод, а также при использовании содержащихся в них веществ. Например, во Франции активно внедряется новая технология производства кормовых белков из аминокислот и пептидов сточных вод. Она основана на открытой А.Я. Данилевским в 1886 г. реакции пластеино-образования (образование белковоподобных веществ — пластеинов), в которой участвуют протеолитические ферменты.
Источником для крупномасштабного выделения ферментов служат организмы, в которых содержание требуемого фермента составляет не менее 1 %. К ним относятся бактерии (рис. 7.2), некоторые растения (например, проростки злаков, бобовых растений), отдельные ткани и органы животных (например, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта).
Широкое применение ферментативных препаратов определяет темпы их производства и потребления. Лидерами этого направления на мировом рынке являются США, Япония и страны Западной Европы. Так, объем продаж ДНКа-зы составил в 2000 г. примерно 100 млн долларов.
В то же время препараты чистых ферментов имеют ряд недостатков: они достаточно дороги, нестабильны и быстро разрушаются при хранении либо требуют специальных условий хранения (низкая отрицательная температура — до -80 °С, добавление коферментов и субстратов), их невозможно использовать многократно, трудно отделить от исходных субстратов и продуктов реакции.
|
|
Решить эти проблемы удалось с помощью инженерной энзимологии — науки, появившейся в 1960-е гг. и создавшей иммобилизованные ферменты. Достижения инженерной энзимологии дали начало развитию нового направления аналитической химии — безреагентных методов анализа, основанных на использовании различных биохимических сенсоров. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связанным с использованием других реагентов, концентрированием и т. д. (отсюда и название — безреагентные методы анализа).
Иммобилизованные ферменты
Иммобилизованными называют такие ферменты, которые выделены из клетки, искусственно закреплены на носителе и сохраняют свойственную им каталитическую активность.
Иммобилизация — это технология, согласно которой молекулу фермента включают в какую-либо фазу или соединяют с нерастворимым носителем. Комплекс «фермент — носитель» отделен от раствора, но при этом может обмениваться с ним молекулами субстрата, эффектора или ингибитора. В промышленных целях для иммобилизации используют главным образом энзимы, выделенные из микроорганизмов. Они примерно в 100 раз дешевле, чем ферменты животного или растительного происхождения, и более доступны.
По сравнению со свободными ферментативными препаратами, иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества:
|
|
— они обладают высокой стабильностью, в несколько тысяч раз превышающей стабильность свободных ферментов, и поэтому достаточно долговечны;
— они легко отделимы от реакционной среды, что позволяет получать чистые продукты реакции;
— иммобилизация дает возможность многократно использовать ферментативный препарат;
— иммобилизованные ферменты технологичны, что позволяет либо вести процесс непрерывно, регулировать его скорость и, соответственно, выход продукта, либо в любой момент остановить реакцию;
— с помощью подбора носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно изменять некоторые свойства ферментов (специфичность, рН- и температурозависимость, стабильность) для оптимизации процесса.
Процесс иммобилизации как способ сохранения активности выделенного из клетки фермента был открыт еще в начале XX в. В 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, адсорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность. Однако первый патент на применение иммобилизованных ферментов был выдан только в 1939 г. Дж. Пфанмюлеру и Г. Шлейху, которые предложили использовать протеолитические ферменты, адсорбированные на древесных опилках, для обработки шкур животных. В 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт разработали принципиально новый метод для иммобилизации ферментов — ковалентное связывание. Что касается термина «иммобилизованные ферменты», то он был узаконен в 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии, которая проходила в США.
Носители для иммобилизации ферментов должны обладать определенными свойствами:
— высокой биологической и химической стойкостью;
— нерастворимостью;
— высокой механической прочностью;
— значительной гидрофильностью, которая обеспечивает связывание фермента с носителем в водной среде;
— достаточной проницаемостью для ферментов, коферментов, субстратов и продуктов реакции, пористостью,большой удельной поверхностью;
— легкостью активации комплекса «фермент — носитель»;
— возможностью создания различных структур (мембран, пластин, трубочек, гранул);
— низкой стоимостью.
В зависимости от структуры, носители подразделяют на природные и синтетические, органические и неорганические, полимерные и низкомолекулярные.
Природные полимерные носители по своей химической природе подразделяют на белковые (кератин, фиброин, коллаген, желатин), полисахаридные (целлюлоза, декстран, агароза, каррагинан, альгиновые кислоты и их соли, аминополисахариды — хитин и хитозан) и липидные (модель «фермент — липид» в виде монослоя или бислоя сферической формы — липосома), наиболее приближенные к естественным комплексам, существующим в клетке.
Синтетические полимерные носители подразделяют на три группы — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. Благодаря разнообразию, механической прочности и доступности, они широко используются для иммобилизации. Кроме того, при производстве синтетических полимеров можно значительно разнообразить их форму (гранулы, трубочки и т. д.), варьировать величину пор, вводить различные функциональные группы.
Носители неорганической природы могут быть представлены материалами из глины, стекла, керамики, сили-кагеля, графитовой сажи, а также оксидами металлов и т. д. Преимущества этой группы носителей состоят в легкости регенерации, возможности получения любой их формы при производстве и вариабельности размера пор.
Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизацию ферментов можно осуществлять физическими и химическими методами (рис. 7.3).
Физические методы основаны на адсорбции фермента на нерастворимом носителе, на включении фермента в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры.
Адсорбция ферментов на нерастворимом носителе. Молекула фермента удерживается на поверхности носителя благодаря электростатическим, гидрофобным, дисперсионным взаимодействиям или возникновению водородных связей. Прочность связывания фермента с носителем небольшая.
Иммобилизация ферментов путем включения в гель (обычно — полимерный гель). Метод обеспечивает равномерное распределение фермента в объеме носителя, достаточно прост и применяется для иммобилизации отдельных молекул определенного энзима, мультиферментных комплексов и интактных клеток. Однако он непригоден для работы с ферментами, которые воздействуют на водонерастворимые субстраты.
Иммобилизация в полупроницаемые структуры. В этом случае раствор фермента и раствор субстрата разделяют с помощью полупроницаемой мембраны (микрокапсулирование, включение в липосомы). Метод используется главным образом в фундаментальных научных исследованиях и в медицине.
Использование химических методов приводит к возникновению ковалентных связей между ферментом и носителем. Этот способ получения промышленных биокатализаторов наиболее распространен.
Химическое присоединение энзима к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Однако химические методы иммобилизации сложны и дороги, но незаменимы в научных исследованиях при создании ферментов с контролируемыми свойствами. Рассмотрим некоторые из этих методов.
Иммобилизация на носителях, несущих гидроксигруп-пы. В этой группе наиболее распространен бромциановый метод, который позволяет связывать фермент с полисаха-ридным или синтетическим носителем.
Иммобилизация на носителях, несущих аминогруппы. Аминогруппы носителя превращают в соли диазония, к которым впоследствии присоединяют молекулы ферментов за счет взаимодействия с фенольными, аминными, имидазольными, тиольными, гуанидиновыми группами этих ферментов. Иммобилизация на носителях, несущих сульфгидрильные группы. Если и носитель, и фермент несут сульфгидрильные группы, то под воздействием кислорода воздуха эти группы легко окисляются с образованием дисульфидных связей.
Среди всех методов иммобилизации оптимальным считается метод включения ферментов в полимерные гели. Также широко распространены адсорбционное присоединение и химические методы, основанные на ковалентном связывании. Достаточно часто иммобилизацию проводят за счет включения ферментов в мембраны и микрокапсулы, тогда как другие приемы используют в единичных случаях. Применение иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферменты находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства:
— в промышленности — в качестве активных компонентов стиральных и моющих средств, в дубильных процессах, в пищевых производствах, например при обработке мяса; в качестве катализаторов при проведении различных технологических процессов, для анализа различных веществ;
— в медицине — в качестве противовоспалительных, тромболитических и фибринолитических препаратов;
— в фармации — в медицинской диагностике при анализе лекарственных веществ белковой природы;
— в качестве биокатализаторов в биотехнологических производствах.
Созданы искусственные аналитические системы для анализа различных веществ — ферментные электроды, проточные анализаторы и т. д. В настоящее время разрабатываются новые поколения биодатчиков на базе аффинных взаимодействий.
7.3. Иммобилизованные полиферментные системы
О широком применении ферментов в медицине уже шла речь выше. Однако использование белковых препаратов в качестве лекарственных средств может быть ограничено их иммуногенностью, аллергенностью, малым временем действия в организме человека или животного. В связи с этим в медицине более перспективно применение иммобилизованных ферментов, которые менее аллергенны и иммуноген-ны, более стабильны, обладают пролонгированным действием. Например, при включении в липосомы ферменты защищены от эндогенных протеиназ организма пациента, а сами липосомы утилизируются в организме. В иммобилизованном виде применяют тромболитические ферменты, предотвращающие образование тромбов в кровеносных сосудах. Иммобилизованные протеолитические ферменты помогают при лечении ожогов, абсцессов, ран. Иммобилизованная уреаза используется в аппарате «искусственная почка». Микрокапсулы, заполненные аспарагиназой, применяют для лечения аспарагинзависимых опухолей.