Иммуноферментный анализ является иммунохимическим методом и применяется с диагностической целью. Использование этого метода включает в себя проведение следующих этапов:
1. Производится сорбция на твердую основу антигена для выявления антител к нему (в лунки полистеронового ИФА планиата).
2. Вносится антиген в лунки биопроб, в которых выявляются специфические антитела.
3. Производится инкубация системы, во время которой происходят специфические взаимодействия антител и антигена на твердой основе.
4. Производится инкубация системы в течение определенного времени после внесения в систему раствора фермента, молекулы которого конъюгированы с антивидовыми антииммуноглобулинами;
5. В систему вносится хромогенный субстрат, разлагающийся под действием фермента с антивидовыми антителами;
6. Происходит образование окрашенного продукта, этот процесс выявляется фотометрически или визуально. Метод твердофазового неконкурентно-иммуноферментного анализа, лежащего в основе методов группы ЭЛИ-тест, обладает следующими преимуществами:
1) возможностью использовать минимум исследуемого материала;
2) высокой чувствительностью;
3) стабильностью реагентов;
4) возможностью автоматизации.
Применяются и другие иммунологические методы диагностики: встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ), радиоиммунный анализ (РИА) и др.
Определение антител к определенным классам иммуноглобулинов (JgM, JgG, JgA и др.) дает возможность дифференцировать заболевание с другими иммунными заболеваниями.
Глава 7
Оценка иммунного статуса
Иммунный статус организма представляет собой количественную и качественную характеристику составных частей иммунной системы на определенном этапе развития организма или определенной стадии развития заболевания. Очень часто эффективность работы иммунной системы сопряжена с уровнем сопряженности ее компонентов.
При наличии дефектов звеньев иммунной системы может произойти компенсация возникших дефектов или нарушение функций иммунной системы с возникновением различных заболеваний.
При заболеваниях, связанных с повреждениями иммунной системы, существует необходимость оценки иммунного статуса, потребность идентифицировать нарушенное звено иммунитета для выбора метода лечения, оценки его эффективности и подбора адекватного лечения. Существует несколько вариантов оценки иммунного статуса.
При двухэтапном варианте методики на первом этапе выявляют грубые дефекты фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета. Для этого определяют абсолютное и относительное содержание лимфоцитов периферической крови; Т– и В-лимфоциты, основные классы иммуноглобулинов, фагоцитарную активность.
На втором этапе проводятся аналитические тесты с включением методик определения функциональной активности фагоцитов, естественных киллеров, Т– и В-клеток.
В последующем была введена трехэтапная оценка иммунного статуса.
На первом этапе определяются количество и морфология лимфоцитов, уровень иммуноглобулинов, производятся кожные тесты, проводится рентгенологическое обследование органов лимфатической системы.
На втором этапе проводится гистохимический анализ лимфоидных органов в проточном цитометре с использованием моноклональных антител, а также анализ цитотоксичности поверхностных маркеров мононуклеарных клеток. Третий этап включает в себя:
1) определение активности ферментов;
2) определение гормонов вилочковой железы;
3) анализ фагоцитов;
4) определение компонентов системы комплемента;
5) выявление иммунопродуцирующих фракций В-лимфоцитов;
6) проведение анализа генетических и хромосомных данных. Наиболее информативными считаются данные иммунологического обследования:
– количественная и качественная оценка иммуноглобулинов, иммунных комплексов;
– определение цитокинов;
– определение компонента комплемента;
– определение белков.
Кроме этого проводятся клеточные исследования, включающие в себя определение:
– субпопуляций лимфоцитов;
– клональности лимфоидных клеток;
– продукции иммуноглобулинов;
– функции активности лимфоцитов, тучных клеток, эозинофилов.
В последние годы широко применяется оценка В-звена иммунитета, способность В-лимфоцитов синтезировать иммуноглобулины, проводится оценка способности Т-лимфоцитов продуцировать цитокины, влияющие на макрофаги, НК-клетки.
Материалом для исследования служит сыворотка крови и клетки периферической крови. По показаниям проводятся исследования костного мозга и лимфатической системы.
В различные возрастные периоды иммунологические показатели и показатели нормального уровня лейкоцитов отличаются (табл. 4–5).
Таблица 4. Нормальное содержание лейкоцитов
Примечание. М – среднее значение; интервал – центральный диапазон; % – доля от числа белых клеток.
Таблица 5. Нормальные иммунологические показатели (из Nelson Textbok, 2003)
Схема исследования клеточного и гуморального иммунитета, факторов неспецифической защиты (табл. 6–8):
1. Исследование венозной крови (лейкоцитограмма).
2. Идентификация Т– и В-лимфоцитов методом непрямой иммунофлюоресценции в сыворотке крови.
3. Исследование методом радиальной иммунодиффузии иммуноглобулинов сыворотки крови (по методу Манчини).
4. Исследование циркулирующих иммунных комплексов осаждением в полиэтиленшкале.
5. Оценка активности фагоцитов путем определения фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.
Таблица 6. Показатели клеточного звена иммунитета в возрасте 30–50 лет
Таблица 7. Показатели гуморального звена иммунитета в возрасте 30–50 лет
Таблица 8. Фагоцитарная активность полиморфноядерных лейкоцитов у здоровых лиц в возрасте 30–50 лет
Примечание. Фагоцитарный индекс представляет собой процент клеток, вступивших в фагоцитоз, к их общему числу. Фагоцитарное число – среднее содержание фагоцитированных частиц в одной нейтрофильной грануле.