Изучить теоретический блок.
ОСНОВЫГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ
Требования, предъявляемые к гистологическому препарату:
- Структура препарата должна соответствовать прижизненному строению органа и ткани.
- Препарат должен быть тонким и прозрачным.
- Препарат должен быть окрашенным.
- Препарат должен длительно храниться (это достигается заключением в бальзам).
Основные этапы приготовления гистологического препарата для светооптического исследования:
I. Взятие материала
Требования, предъявляемые к взятию материала:
1. Материал должен быть свежим.
2. Иссечение кусочков производим скальпелем или бритвой.
3. Нельзя промывать водой или протирать тряпкой.
4. Брать материал следует с минимальной затратой времени.
5. Объем кусочка должен быть не более 0,5-1 см3.
6. Взятие материала должно производиться сообразно строению органа.
7. Если мы имеем дело с опухолевым участком, то материал должен браться на границе больного и здорового участков.
II. Фиксация – метод обработки живого объекта фиксирующими веществами с целью сохранения прижизненной структуры органа или ткани.
Механизм фиксации основан на коагуляции белков.
Виды фиксаторов:
А) Физические:
1.холод (замораживание)
2.лиофильная сушка (сушка на морозе)
Б) Химические:
1. Простые – состоят из одного ингредиента:
- 10% формалин
- 96% спирт, ацетон
- 2% осмиевая кислота (для электронной микроскопии)
- трихлоруксусная кислота 5-10% раствор
- пикриновая кислота (2% раствор)
- 5% уксусная кислота
- соли тяжелых металлов: ртути (сулема), платины, урана и др.
- сульфосалициловая кислота
2. Сложные:
- смесь Буэна (пикриновая кислота, формалин, уксусная кислота)
- смесь Карнуа (спирт, формалин, уксусная кислота)
- смесь Ценкера (бихромат калия, сернистый натрий, сулема, уксусная кислота)
Правила фиксации:
1. Объем фиксатора в 20-40 раз должен превышать объем фиксируемого объекта.
2. Время фиксации определяется объемом кусочка и выбором фиксатора.
3. Выбор фиксатора зависит от целей и задач исследователя.
III. Промывка в воде – для водорастворимых фиксаторов и в спирте – для спирторастворимых фиксаторов.
Цель: освобождение от фиксатора.
IV. Обезвоживание и уплотнение - проводят по батарее спиртов возрастающей концентрации (крепости).
Основное правило: правило постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.
Если применяли водорастворимый фиксатор, тогда батарея спиртов следующая:
300→400→500→600→700→800→900→960 I→960 II→1000 абсолютный спирт
Если применяли спирторастворимый фиксатор, батарея спиртов начинается с 700 спирта: 700→800→900→960I→960 II→1000 абсолютный спирт
V. Заливка – пропитывание веществами представляющими собой плотные среды. Заливку производят в парафин и в целлоидин.
А) Парафиновая заливка
Парафин не растворяется в спирте, зато растворяется в органических растворителях (бензол, ксилол, толуол, хлороформ). Прежде чем материал залить в парафин, его нужно провести через ряд промежуточных сред:
спирт + ксилол → ксилол I → ксилол II → ксилол + парафин (t = 370) → парафин I (t = 560) → парафин II(t = 560) → заливочный парафин (содержит 5% воска)
Положительные стороны парафиновой заливки:
1) Можно делать тонкие срезы ≈ 5 мкм
2) Относительная быстрота проводки: время нахождения в различных средах зависит от структуры органа и размера кусочка и подбирается опытным путем.
Отрицательные стороны парафиновой заливки:
1) Воздействие на объект высоких температур, что часто приводит к высушиванию и деформации материала.
2) Возможность заливать только мелкие объекты
Б) Целлоидиновая заливка
Целлоидин – это нитроклетчатка, для этой цели используют рентгеновские пленки, которые растворяются в смеси спирт + эфир. Получается жидкий целлоидин. Проводку осуществляют в последовательности:
Спирт + эфир → 2% целлоидин → 4% целлоидин → 6% целлоидин → 8-10% целлоидин. Далее помещают заливаемый объект в чашку Петри с 10% целлоидином и приоткрывают крышку, чтобы среда получилась эластичной. Затем вырезают объект вместе со средой и приклеивают с помощью густого целлоидина к деревянному блоку. Такой гистологический блок хранят в банке с 70-градусным спиртом, чтобы предотвратить от высыхания. Парафиновые блоки можно хранить при комнатной температуре.
Положительные стороны парафиновой заливки:
1) можно заливать более крупные объекты
Отрицательные стороны парафиновой заливки:
1) невозможность получить тонкие срезы, толщина срезов =20 мкм
VI. Резка
Резку осуществляют на приборе под названием микротом.
Основной элемент микротома – стальной нож.
Микротом может находиться внутри прибора, который поддерживает постоянную t ≈ - 18-200. Он носит название криостат. Этот прибор широко используется для экспресс–диагностики во время хирургических операций, для научных исследований, для гистохимических методов исследования, так как этапы фиксации и уплотнения осуществляются одновременно благодаря замораживанию при низких температурах и существенно экономят время исследования.
После резки парафиновый срез помещают в каплю воды на предметное стекло и слегка подогревают на термостолике, чтобы срез расправился. Далее оставляют стекло до полного высыхания воды.
VII. Депарафинизация.
Прежде чем окрашивать гистологический срез, необходимо освободиться от парафина и наводнить препарат, так как обычные гистологические красители водные. Препарат на предметном стекле погружают в следующие растворы:
ксилол I → ксилол II → 960 I → 960 II → 700 → Н2О
VIII. Окрашивание
Препарат окрашивают сначала ядерным красителем, затем цитоплазматическим.
Виды красителей:
А) ядерные (основные)
· гематоксилин (окрашивает ядро в синий цвет)
· железный гематоксилин
· азур II (в фиолетовый цвет)
· кармин (в красный цвет)
· сафранин (в красный цвет)
· метиловый синий (в синий цвет)
· толуидиновый синий (в синий цвет)
· тиониновый синий (в синий цвет)
Б) цитоплазматические (кислые)
· эозин – окрашивает цитоплазму в розовый цвет
· эритрозин
· оранжевый «G»
· кислый фуксин – в красный
· пикриновая кислота – в желтый
· конго красный- в красный
В) специальные
· судан III – окраска липидов и жиров в оранжевый цвет
· осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет
· орсеин – окраска эластических волокон в коричневый цвет
· азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темно-коричневый цвет
Структуры клетки, окрашиваемые кислыми красителями называются оксифильными (ацидофильными ) – окрашивание в розовый цвет.
Структуры клетки, окрашиваемые основными красителями называются базофильными – окрашивание в синий цвет.
Структуры клетки, окрашиваемые как основными, так и кислыми красителями одновременно называются нейтрофильными – окрашивание в фиолетовый цвет.
IX. Просветление осуществляют в следующих растворах:
Н2О → 700 → 960 I→ 960 II→ ксилолI → ксилол I
X. Заключение в бальзам.
Используют канадский бальзам, так как его коэффициент преломления равен коэффициенту преломления стекла. После нанесения бальзама срез покрывают покровным стеклом. После высушивания гистологический препарат готов для проведения гистологического анализа.
Микроскоп
Рисунок 1. Приготовление гистологических препаратов для световой микроскопии.