ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3.

Тема: “ ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫНА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ ”.

Расщепление крахмала амилазой можно наблюдать, используя реакцию с йодом.

МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: амилаза слюны (наклонив голову, приоткрывают рот, подносят пробирку к нижней губе и собирают слюну).

РЕАКТИВЫ: I₂, 1%-ный раствор в KI; крахмал, 1% раствор; дистиллированная вода, фосфатный буфер с разным значением рН (5,4 - 8,0).

ОБОРУДОВАНИЕ: пипетки, пробирки, термостат (40⁰С), водяная баня и баня со льдом, предметные стекла.

ХОД РАБОТЫ.

1. Наливают в четыре пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в четыре пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:10) слюны.

2. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая с крахмалом) и помещают в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (40⁰С), четвертую - в кипящую водяную баню.

3. Через 10 мин. содержимое каждой пары пробирки сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 минут в тех же условиях.

4. Из третьей пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин. и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.

ОФОРМЛЕНИЕ РАБОТЫ: результаты записывают в таблицу; делают выводы о характере влияния температуры на активность амилазы. Сравнивают результаты, полученные с разными образцами слюны.

Занятие 4

«Ферменты» (часть 2)

1. Зависимость скорости ферментативной реакции. Действие факторов окружающей среды (температура, рН).

2. Коферменты, кофакторы, их роль в ферментативном катализе.

3. Кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

4. Регуляция ферментативной активности: ингибирование и активация. Определение параметров ферментативной реакции и вида ингибирования с использованием графической интерпретации уравнения Лайндивера-Берка.

5. Органоспецифичность ферментов. Изоферменты. Антиферменты. Энзимопатия. Применение ферментов в медицине.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4.

Тема: «Влияние рН на активность амилазы слюны ».

Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с раствором йода в течение времени. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки оптимального рН в кислую или щелочную зону расщепление крахмала произойдет только частично до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

ХОД РАБОТЫ.

1. Перед началом работы готовят раствор амилазы и определяют ее активность. Для этого смешивают 1 мл раствора крахмала и 0,5 мл разбавленной 1:10 слюны. Через каждые 2 минуты отбирают по 1 капле этой смеси и смешивают ее с каплей раствора йода на предметном стекле. Крахмал должен полностью расщепляться приблизительно за 10 минут (появляется желтая окраска при пробе с йодом). Если расщепление происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2, 3 или 4 раза.

2. В восемь пронумерованных пробирок добавляют по 2 мл фосфатного буфера с различным рН (от 5,4 до 8,0).

Следует помнить, что при отмеривании разных буферных растворов нельзя пользоваться одной пипеткой. Необходимо использовать каждый раз чистую пипетку (или наливать из бюретки).

3. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл приготовленного раствора слюны (разбавленного в зависимости от активности амилазы 1:10; 1:20; 1:50) и оставляют стоять в штативе на столе в течение 10 мин.

4. Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин. до тех пор, пока проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с первой пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают.

Сравнивая между собой окрашивание во всех пробирках, делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении рН среды.

Оформление работы: Результаты вносят в таблицу:

Делают вывод о характере влияния рН на активность амилазы. Отмечают оптимальное рН для действия амилазы.

Занятие 5.