Данная работа выполняется на стыке нескольких научных направлений: органической химии, аналитической химии, микробиологии и биохимии. Это требует применения нескольких подходов к достижению научного результата.
Перед проведением экспериментов по изучению динамики изменения концентрации ФКС в модельных средах необходимо разработать и провести валидацию методик получения данных. В качестве основных методов при постановке методик выступает высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография-хроматомасс-спектрометрия (ГХ-МС). Электронная спектроскопия в данном случае даст необходимые данные о характере поглощения света в УФ-диапазоне длин волн (190-380 нм), выявит характерные максимумы поглощения, что необходимо для выбора измерительной и контрольной длин волн при разработке ВЭЖХ-методик с применением спектрофотометрического детектирования (ВЭЖХ-УФ). В качестве дополнительного критерия идентификации, наряду с традиционным критерием – временами удерживания, предполагается использовать отношения сигналов измерительной и контрольной длин волн, получаемых одновременно, что является новым приемом при анализе, повышающим надежность разрабатываемых методик.
В связи с тем, что некоторые из интересуемых ФКС не являются летучими, то перед проведением разделения на газовом хроматографе необходимо проводить процедуру получения летучих производных (дериватизация). В качестве способа дериватизации предлагается силилировать анализируемые соединения. Силилирующим агентом будет выступать N-триметилсилилимидазол. В плане трудозатрат эффективнее всего было бы применение системы ВЭЖХ-масс-спектрометр (ВЭЖХ-МС), но стоимость системы и ее обслуживания очень велика и в некоторых случаях превышает стоимость оборудования ГХ-МС в несколько раз.
Для приготовления модельных сред необходимо учитывать наличие в них источника углерода и энергии, а также других компонентов, которые необходимы для возможного роста микроорганизмов в данных растворах. Важно также подобрать эффективный ингибитор микробиологического роста для учета и оценки возможных небиохимических преобразований исследуемых соединений.
Не менее важным аспектом является поиск метаболитов, образующихся в ходе деградации исследуемых соединений. Анализ путей и механизмов биологического окисления, конъюгации, гидролиза, а также свойств возможных метаболитов необходим при идентификации сигналов на хроматограммах.
Сама идея применения хроматографии в качестве метода анализа и контроля за содержанием функционализованных карбоароматических соединений не является сложной. Основные трудности заключаются в разработке метода подготовки образцов и подбора условий для анализа, так как в ходе деградации в модельной среде может образовываться большое количество мешающих соединений, сигналы которых будут регистрироваться на хроматограммах и блокировать входные фильтры колонок и предколонок ВЭЖХ-системы и инжектора газового хроматографа, что будет негативным образом сказываться на таких параметрах разделения как эффективность, селективность, разрешение, фактор асимметрии пиков. Следовательно, для детального изучения деградации ФКС, необходимо наиболее полное использование материально-технической базы научно-образовательного центра и центра коллективного пользования.
Для изучения молекулярной специфики механизмов деградации функционализованных карбоароматических соединений предполагается проведение экспериментов методами квантово-химического моделирования. Наибольший интерес в этом плане представляют реакции окислительной дециклизации (окислительного разрыва цикла) ФКС. В качестве рабочих моделей будут взяты комплексы каталитических центров ферментов диоксигеназ с соответствующими органическими субстратами. В расчетах предполагается использовать методы теории функционала плотности. Теория функционала плотности открывает широкие возможности в проведении расчетов больших систем, при этом у данного подхода существует еще одно направление, которое можно назвать «концептуальной теорией функционала плотности». Как показала практика, аппарат теории функционала плотности позволяет заново рассмотреть основы целого ряда химических концепций и принципов, таких, например, как электроотрицательность, теория мягких и жестких кислот и оснований и др. Одним из наиболее эффективных и надежных на сегодняшний день является метод гибридных функционалов B3LYP (Becke, three-parameter, Lee-Yang-Parr), который будет использоваться при расчетах. Данное направление исследований в настоящее время является относительно новым, что подтверждается наличием публикаций по данной тематике за 2007-2012 года в журналах «American Chemical Society».
Ожидаемые научные результаты, которые планируется получить по завершению проекта (развернутое описание с оценкой степени оригинальности; форма изложения должна дать возможность провести экспертизу результатов)
В ходе выполнения работы планируется:
1) Разработать методические схемы для анализа ФКС в модельных системах методами ВЭЖХ-УФ и ГХ-МС.
2) Получить данные о динамике изменения концентрации целевых соединений при экспонировании целевых соединений в модельных средах. В качестве контрольного варианта предполагается использовать модельный раствор с добавлением ингибитора микробиологического роста.
3) Получение информации о качественном и количественном составе химических продуктов и метаболитов, образующихся в ходе деградации ФКС. Для этих целей будут применены чувствительные, точные и надежные методы ВЭЖХ-УФ, ГХ-МС.
4) На основании данных о динамике изменения концентрации в опытном и контрольном вариантах модельных сред, а также данных о составе метаболитов и продуктов будет сделан вывод о преобладающих путях деградации ФКС.
5) Проведение экспериментов с использованием квантово-химических методов, в частности, методов теории функционала плотности. Будут подобраны и верифицированы различные варианты рабочих исходных моделей фермент-субстратных комплексов. Предполагается получение данных о пространственных отношениях и параметрах фермент-субстратных комплексов, о переходных состояниях и интермедиатах реакции окислительной дециклизации ФКС. Верификация исходных и конечных моделей будет проведена путем анализа мнимых частот в колебательном спектре.
Полученные данные о динамике деградации ФКС в модельных средах, о составе метаболитов и продуктов деградации, об особенностях механизмов реакций окислительного разрыва цикла, а также разработанные методы определения ФКС в модельных средах могут быть в дальнейшем использованы при анализе природных объектов и других более сложных матриц, таких как пищевые продукты, косметические изделия и фармацевтические препараты, а также при прогнозировании возможного потенциала деструкции ФКС в окружающей среде.
Имеющийся у коллектива научный задел по предлагаемому проекту: полученные ранее результаты (с оценкой степени оригинальности), разработанные методы (с оценкой степени новизны)
Данная работа входит в серию исследований количественного анализа и изучения деградации органических соединений в продуктах питания, косметике и фармацевтических препаратах и природных средах. По материалам работы опубликованы четыре статьи в центральной печати, одна статья направлена в редакцию журнала.
У руководителя проекта (Лебедев А.С.) есть опыт руководства при исполнении контракта Минобрнауки России по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 14.132.21.1452), а также участие в качестве исполнителя НИОКР в программе «У.М.Н.И.К» (договор № 14/17150-2013).
Исполнитель проекта Осипян Кристине Мгеровна имеет опыт работы на проектом, поддержанным Минобрнауки России по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (соглашение № 14.132.21.1452).
Подана заявка на патентование изобретения.
Результаты работы коллектива регулярно докладываются на конференциях и выставках различного уровня, в том числе и международных (Ломоносов, 2013; НТТМ, 2013).
Из имеющихся на данный момент результатов работы получены УФ-спектры бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой кислот, левомицетина, левомицетина сукцината натрия, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты.
Разработаны методы идентификации и количественного определения левомицетина, бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой кислот, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты методом ВЭЖХ-УФ.
Разработана методика определения остаточных количеств левомицетина в водно-органической матрице сложного состава, в качестве которой выступили сырое и пастеризованное коровье молоко. Методика впервые использует технику твердофазной экстракции на обращенно-фазовом мелкозернистом нанопористом носителе С16, позволяющая, с одной стороны, эффективно элиминировать мешающие анализу компоненты образца, с другой данная техника позволяет сконцентрировать левомицетин на сорбенте из исследуемой пробы. В данном случае имеет место десятикратное концентрирование. Все методики в качестве дополнительного критерия идентификации используют отношения сигналов, измеряемых на двух длинах волн одновременно.
Разработаны методические схемы анализа парабенов в образцах пищевых продуктов, косметических изделий, фармацевтических препаратов методом ВЭЖХ-УФ
Подобран предварительный состав модельных сред.