Определение массовой доли белка методом

КЬЕЛЬДАЛЯ

Метод основан на минерализации навески продукта при нагревании с концентрированной серной кислотой в присутствии катализато­ров. При этом углерод и водород органических соединений окис­ляются до диоксида углерода и воды, азот, освобождаемый в ви­де аммиака, соединяется в колбе с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Схематично происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:

RCHNH₂COOH +H₂SO₄ = СО₂+ SO₂ + H₂O + NH₃.

2NH₃+ H₂SO₄—(NH₄)₂SO₄.

На последующей стадии дистилляции раствор сульфата ам­мония обрабатывают концентрированным раствором гидроксила натрия, при этом аммиак освобождается и улавливается титро­ванным раствором серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором гидроксида натрия. Метод Кьельдаля применяют в нескольких модификациях, отличающихся в основ­ном условиями минерализации. Для ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен, свинец и другие, повышают температуру кипения серной кислоты добавлением со­лей, сульфата калия или натрия, сочетают добавление катализа­тора и солей при сжигании навески.

Методом Кьельдаля в любой модификации определяется ко­личество общего азота. Массовая доля белка вычисляется умно­жением полученной величины общего азота на переводной коэф­фициент 6,25, исходя из того, что в белках в среднем содержится 16% азота. Условность полученных результатов при таком пере­счете очевидна, так как не весь азот пищевого продукта находит­ся в форме белка и, кроме того, процентное содержание азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые вещества небелкового характера достигают значительных коли­честв (мышечная ткань рыбы—15%, мясо животных—10— 16% от общего количества азотистых веществ).

Следовательно, для получения более точных результатов не­обходимо либо при пересчете общего азота на белок использо­вать различные коэффициенты в зависимости от процентного со­держания азота в белках отдельных продуктов: мясо и овощи — 6,25; пшеница, рожь, горох и др. — 5,7; гречиха, рис — 6,0; моло­ко — 6,37 и т. д., либо белковый азот определять отдельно специ­альными методами.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ

МЕТОДОМ

Спе­цифической реакцией на содержание белка является биуретовая реакция, так как ее дают полипептидные связи. Она получила свое название от производного мочевины — биурета, который об­разует в щелочном растворе медного купороса окрашенное комп­лексное соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональ­на содержанию пептидных связей, а, следовательно, и концент­рации белка в растворе.

Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипепти­ды, начиная с тетрапептидов.

Эта реакция длительное время использовалась как качественная реакция на белок. В дальнейшем она стала применяться для количественного определения белка в различных объектах. Биуретовый метод применяют в различных модификациях, раз­личающихся условиями экстрагирования белка, способами вне­сения биуретового реактива и техникой колориметрирования.

Ниже приводится биуретовый метод определения массовой доли белка в муке в модификации Дженнингса, экспериментальная проверка которого выяви­ла ряд его преимуществ перед другими модификациями.

Биуретовый реактив— 15 см³ 10 н. раствора КОН и 25 г сегнетовой соли, взятой с погрешностью ±0,01 г, растворяют примерно в 900 см³ дистиллирован­ной воды в мерной колбе вме­стимостью 1000 см³. Медленно добавляют при постоянном перемешивании 30 см³ 4 %-ного раствора CuSO₄, отмерен­ных цилиндром, и доводят объем колбы до метки дистил­лированной водой.

ТЕХНИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Взвешивают около 1,5 г муки с погрешностью ±0,001 г и помещают в сухую коническую колбу вместимостью 250—300 см³, снабженную пробкой. Отмеривают цилиндром с ценой деления 0,1 см³ под тягой 2 см³ четыреххлористого углерода для извлечения жира из образца, добавляют пи­петкой 100 см³ биуретового реактива. Закрытую пробкой колбу встряхивают на механическом встряхивателе в течение 60 мин. Далее вытяжку центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 4500 мин-¹. Прозрачный центрифугат помещают в кю­веты фотоэлектроколориметра с толщиной слоя раствора 5 мм. Измерение оптической плотности производят при длине волны 550 нм.

По величине оптической плотности белковой вытяжки опреде­ляют содержание белка в навеске (мг) с помощью калибровоч­ной кривой (рис. 1). Рассчитывают массовую долю белка (в %) на сухие вещест­ва муки.