Маркеры множественной лекарственной устойчивости при острых миелоидных лейкозах

Резюме
Множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) называют резистентность клеток к ряду лекарственных препаратов, различающихся по химической структуре и механизму действия. Наиболее изученным фактором, определяющим наличие у клетки феномена МЛУ, являются белки из семейства АВС-транспортеров. По данным литературы, признана роль в развитии феномена МЛУ Pgp, MRP1, BCRP, а также LRP. Мы определяли экспрессию данных белков у первичных больных ОМЛ (кроме М3). Экспрессия данных белков наблюдалась у 64,3, 46,4, 64,3 и 42,9% больных соответственно. Бластные клетки всех больных, не ответивших на терапию, экспрессировали более одного маркера МЛУ, у 80% резистентных больных отмечена экспрессия трех и четырех маркеров, в то время как в группе чувствительных больных 1–2 маркера экспрессировались у 83% пациентов.
Ключевые слова: ОМЛ, Pgp, MRP1, BCRP, LRP

За последние годы достигнут несомненный прогресс в изучении острых миелоидных лейкозов (ОМЛ). Благодаря исследованиям патологов, клиницистов, генетиков раскрыты некоторые механизмы патогенеза, определены факторы прогноза. Все это привело к тому, что заболевание, бывшее фатальным для 100% больных, в настоящее время расценивается как потенциально излечиваемое. При использовании современных схем ПХТ 5-летняя безрецидивная выживаемость составляет 45–50%, проведение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток увеличивает этот показатель до 55–60%.Основной задачей, стоящей перед клиницистом при лечении первичного больного с ОМЛ, является достижение полной клинико-гематологической ремиссии. Современная терапия ОМЛ позволяет получить полные ремиссии у 65–80% первичных больных. По данным отечественных исследователей (Российская группа по изучению острых лейкозов), этот показатель составляет 64% [1]. Несмотря на очевидные успехи в лечении острых нелимфобластных лейкозов (ОНЛЛ), приблизительно у 10–20% пациентов при применении стандартной химиотерапии не удается получить полной ремиссии. Данная группа больных представляет большую клиническую проблему, так как эффективность схем второй линии химиотерапии, основанных, главным образом, на высоких дозах цитарабина, не превышает 20%. Использование новых препаратов, таких как ингибиторы топоизомеразы II (топотекан), производные платины (карбоплатин), флударабин, не улучшило ситуацию. Применение столь агрессивного метода лечения, как аллогенная трансплантация костного мозга, позволяет надеяться на долговременную выживаемость у 10% первично-резистентных больных. Таким образом, первичная резистентность, т.е. отсутствие полной ремиссии после проведения 1–2 курсов современной индукционной химиотерапии в адекватных дозах, является крайне неблагоприятным фактором прогноза и представляет собой одну из основных проблем современной онкогематологии, для решения которой проводятся многочисленные исследования.

В последние годы все больший интерес исследователей привлекает феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). МЛУ называют резистентность клеток к ряду лекарственных препаратов, различающихся по химической структуре и механизму действия [2]. От момента открытия данного феномена и до наших дней ОМЛ является наилучшей экспериментальной моделью для изучения механизмов устойчивости злокачественных клеток к действию цитостатиков. Это обусловлено высокой чувствительностью клеток к химиотерапии, относительной простотой их получения и культивирования.

Наиболее изученным фактором, определяющим наличие у клетки феномена МЛУ, являются белки из семейства АВС-транспортеров (ATP Binding Cassette transporters, АТФ-зависимые транспортеры; рис. 1). Данная группа объединяет трансмембранные протеины, связывающие АТФ и использующие энергию для транспортировки некоторых молекул через все виды клеточных мембран. Семейство подразделяется на подсемейства A, B, C, D, E, F, и G в зависимости от структуры АТФ-связывающих доменов и в настоящее время насчитывает около 50 белков, 3 из которых имеют значение в развитии феномена МЛУ при ОМЛ [3, 4].

Рис. 1. Структура типичного ABC-транспортера. Желтым показана билипидная мембрана, синим – трансмембранный домен, красным – связывающая последовательность нуклеотидов

Впервые связь мембранных белков-транспортеров с феноменом МЛУ была показана в исследованиях лаборатории Victor Ling при изучении белка с молекулярной массой 170 кД, названного Р-гликопротеином (Pgp), обладавшим способностью уменьшать внутриклеточное накопление и цитотоксичность структурно и функционально различных цитостатиков [5]. Pgp кодируется геном MDR1 (относится к семейству В, международное название АВСВ1), расположенным на длинном плече хромосомы 7 (7q21). Молекула белка имеет внутри- и внеклеточный компонент и 12 раз пересекает цитоплазматическую мембрану. Его функцией являются энергозависимый транспорт (эффлюкс) за пределы клетки и уменьшение внутриклеточной концентрации большого числа ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов. Кроме того, последние исследования показывают, что Pgp играет роль в увеличении апоптотического порога клетки. Pgp демонстрирует широкую специфичность к веществам с различной структурой и соответственно определяет устойчивость клеток к большому числу препаратов, таких как алкалоиды барвинка, антрациклины, эпиподофиллотоксины, таксаны, актиномицин D [6, 7]. При ОМЛ гиперэкспрессия MDR1 наблюдается, по данным разных исследователей, у 20–50% первичных больных.

Таблица 1. Экспрессия Pgp и ее влияние на частоту достижения полной ремиссии (%)

Несмотря на предпринятые многочисленные многоцентровые исследования, роль Р-гликопротеина в развитии первичной резистентности у больных ОМЛ до сих пор остается спорной. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, составленной по результатам многоцентровых исследований, в мировой литературе имеются противоречивые результаты: в ряде исследований отмечается достоверно больший процент достижения полных ремиссий в группе пациентов, бластные клетки которых не экспрессируют Pgp, в других работах подобного различия не отмечено [8, 9]. Были предприняты попытки связать гиперэкспрессию белка Pgp с известными прогностически неблагоприятными факторами, включая возраст, цитогенетические аберрации, гиперлейкоцитоз, уровень гемоглобина, экспрессию CD34, вторичный характер ОМЛ. Показана корреляция экспрессии Pgp с наличием маркера CD34 (по данным разных авторов, 50–70% CD34+СD38- клеток имеют Р-гликопротеин) [10, 11]. Неизвестно, оказывает ли молекула CD34 непосредственное влияние на активность Pgp. Встречаются отдельные сообщения о взаимосвязи экспрессии и функциональной активности Pgp с различными ФАБ-вариантами ОМЛ, однако на настоящий момент можно сказать, что экспрессия данного белка практически отсутствует только при остром промиелоцитарном лейкозе, отличающемся высочайшей чувствительностью к антрациклинам и служащем экспериментальной моделью для поиска путей преодоления МЛУ при других ФАБ-вариантах ОМЛ. Несомненной является связь возраста с экспрессией Pgp. В исследовании O. Legrand и соавт. [12], включившем в себя 132 пациента, Pgp определялся лишь у 17% больных моложе 35 лет, в то время как в возрастных группах 35–50 лет и старше 65 лет экспрессия составила 39 и 71% соответственно.

D. Damiani и соавт. [13] считают Pgp независимым фактором прогноза у больных с нормальным кариотипом, поскольку имеющиеся данные убедительно показывают необходимость отнесения больных с гиперэкспрессиией Pgp и нормальным кариотипом в группу неблагоприятного прогноза.

В последние годы проводятся исследования по выявлению взаимосвязи Pgp с новыми факторами прогноза, одним из которых является мутация FLT3. Показано, что бластные клетки, одновременно экспрессирующие Pgp и имеющие мутацию FLT3, отличаются сниженной апоптотической способностью в сравнении с клетками, не имеющими данной ассоциации [14]. Вслед за открытием Pgp исследование злокачественных клеток с фенотипом МЛУ, не связанным с геном MDR1, привело к открытию S.P. Cole и соавт. [15] в 1992 г. в клеточной линии мелкоклеточного рака легкого белка MRP1 (multidrug resistance-associated protein; белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивостью; класс С, ген АВСС1). Этот белок с молекулярной массой 190 кДа, кодируемый геном, расположенным на хромосоме 16 (регион 16р13.1), обеспечивает резистентность примерно к тому же кругу химиопрепаратов, что и Pgp. Он транспортирует отрицательно заряженные ионы, конъюгированные с молекулой глутатиона. В норме белок MRP1 широко распространен в органах и тканях организма, включая клетки гемопоэтической системы. Признано его участие в развитии феномена МЛУ при раке легкого, толстой кишки, молочной железы, мочевого пузыря и простаты, а также при лейкозах. Данные о частоте экспрессии и функциональной значимости белка MRP при ОМЛ весьма противоречивы. По данным D.C. Zhou и соавт. [16], проанализировавших бластные клетки 91 первичного больного ОМЛ, экспрессия MRP1 наблюдалась у 24% пациентов, полные ремиссии в данной группе были достигнуты у 22% по сравнению с 84% в группе пациентов без экспрессии MRP1. M. Filipits и соавт. [17] определяли экспрессию MRP у 121 первичного больного ОМЛ, обнаружив при этом низкий уровень экспрессии у 30% пациентов, средний и высокий – у 46 и 24% соответственно. Экспрессия MRP1 не зависела от классических факторов прогноза (включая цитогенетические аномалии) и не влияла на непосредственные результаты лечения. Показана тенденция к снижению общей выживаемости в группе с высоким и средним уровнем экспрессии MRP1 [17]. В исследовании M. Schiach и соавт. [18] при анализе данных 331 больного показано, что в отличие от Pgp, оказывавшего влияние на непосредственные результаты лечения и общую выживаемость, экспрессия MRP1 является независимым фактором прогноза для безрецидивной выживаемости. Интересные данные опубликованы в 1996 г. B.J. Kuss и соавт. [19], которые, основываясь на локализации гена MRP1 на хромосоме 16, предположили, что дезактивация этого гена при специфической мутации (inv16), характерной для М4 ФАБ-варианта ОМЛ с эозинофилией, является причиной благоприятного прогноза при данном варианте заболевания. Был проведен анализ 22 больных с inv 16, у 5 из них была обнаружена делеция гена MRP, у этих больных отмечены достоверно лучшие показатели выживаемости [19].

Некоторые исследователи высказали предположение, что феномен МЛУ в большей степени связан с коэкспрессией нескольких белковых молекул. Так, O. Legrand и соавт. [12], проанализировав данные 132 больных, показали прогностическое значение одновременного обнаружения Pgp и MRP1 в бластных клетках при ОМЛ.

Активные исследования семейства АВС-транспортеров позволили в 1998 г. группе исследователей под руководством L.A. Doyle [20] выделить из клеточной линии рака молочной железы MCF-7/AdrVp, резистентной к даунорубицину, топотекану и митоксантрону, новый белок этого семейства. Он был назван «белком устойчивости рака молочной железы» (breast cancer resistance protein, BCRP) и отнесен к подсемейству G (ген ABCG2). Было показано, что перенос этого гена в химиочувствительные клеточные линии индуцирует резистентность к вышеуказанным препаратам при сохранении чувствительности к цисплатину, паклитакселу и винкаалкалоидам. Почти одновременно этот белок был выделен в двух других лабораториях, в связи с чем в литературе встречаются синонимичные обозначения MXR (mitoxantrone resistance protein) и ABCP (placental ABC transporter). Ген, кодирующий белок, располагается на длинном плече хромосомы 4 (4q22).

Хорошо известно, что антрациклины являются базисными препаратами при лечении ОМЛ, в связи с чем значение белка BCRP при ОМЛ начало активно изучаться сразу после его открытия. Данные продолжают накапливаться. Например, в исследовании Z. Benderra и соавт. [21] (149 первичных больных ОМЛ), завершенном в 2004 г., экспрессия белка BCRP обнаружена в 52%. В данной группе частота достижения полных ремиссий составила 43% против 69% в группе BCRP-отрицательных пациентов (р=0,005). Значимой корреляции между экспрессией BCRP и Pgp обнаружено не было. Исследователи делают вывод о том, что наихудший прогноз отмечен в группе больных, бластные клетки которых экспрессировали одновременно BCRP и Pgp (45% полных ремиссий в сравнении с 90% в группе без экспрессии обоих маркеров) [21]. Этот вывод был дополнен в более поздней работе той же исследовательской группы. У 81 больного ОМЛ была определена экспрессия MRP, BCRP и Pgp и продемонстрированы достоверно лучшие показатели общей выживаемости у пациентов, в бластных клетках которых белков МЛУ не обнаружено вообще либо обнаружен 1 белок.

В 2006 г. были опубликованы результаты работы итальянской группы исследователей [13], в которую были включены 73 первичных больных ОМЛ. Экспрессия BCRP выявлена у 33% больных, причем статистически значимых различий в достижении полной ремиссии у BCRP-позитивных и BCRP-негативных больных обнаружено не было. Тем не менее, в группе BCRP-позитивных пациентов отмечена достоверно более высокая частота рецидивов (78% против 38%), причем все рецидивы были ранними. В работе вновь подчеркивается важность комплексного исследования фенотипа МЛУ.

Несмотря на отчетливую связь BCRP с транспортом антрациклинов in vitro, до последнего времени не было продемонстрировано преимуществ ни одного из них (даунорубицин, идарубицин, митоксантрон) для преодоления резистентности опухолевых клеток, обусловленной этим белком. Тем не менее в 2002 г. B.L. Abbott с соавт. [22] in vitro показали значение BCRP в развитии резистентности к митоксантрону и топотекану при сохранении чувствительности к идарубицину. Необходимо отметить тот факт, что ни в одном исследовании не было показано статистически значимой связи экспрессии BCRP с классическими неблагоприятными факторами прогноза, в том числе с цитогенетическими аномалиями, что позволяет считать данный белок независимым прогностическим фактором. Помимо вышеописанных белков из семейства АВС-транспортеров, в развитии феномена МЛУ участвует еще ряд факторов. В 1993 г. при помощи моноклонального антитела LRP56 в полирезистентной Pgp-отрицательной клеточной линии рака легкого был выделен белок с молекулярной массой 110 кД, названный белком устойчивости рака легкого – LRP (lung resistance protein). Ген LRP, расположенный на хромосоме 16 в регионе, близком к гену MRP1, является гомологом главного везикулярного белка крыс. Исследования показали, что в отличие от АВС-белков он локализован не на клеточной мембране, а в цитоплазме и ассоциирован с везикулами и лизосомами, что позволяет считать его участником ядерно-цитоплазматического транспорта. Везикулы представляют собой расположенные в цитоплазме частицы, состоящие из РНК и белка. При культивировании клеток, экспрессирующих LRP, с антрациклинами эти препараты обнаруживаются внутри везикул и выводятся из клетки путем экзоцитоза. Гиперэкспрессия LRP в норме наблюдается в тканях толстой кишки, легкого, проксимальных почечных канальцев, коре надпочечников и макрофагов, однако его физиологические функции остаются неизвестными. Белок LRP обнаруживается в клетках различных злокачественных опухолей при отсутствии экспрессии Pgp и MRP1, что аассоциируется с резистентностью к доксорубицину, винкристину, цисплатину и мелфалану.

Первые данные о значении LRP при ОМЛ появились в 1996 г. Группа исследователей под руководством A.F. List [23] на достаточно разнородной группе из 86 больных (первичный и вторичный ОМЛ, РАИБ-Т, бластный криз хронического миелобластного лейкоза) показала, что у LRP-отрицательных пациентов частота достижения полной ремиии достоверно выше (35% против 68%). Была выявлена зависимость экспрессии LRP от возраста (старше 55 лет), подтвержденная во всех последующих исследованиях. В других исследованиях была продемонстрирована взаимосвязь экспрессии LRP с лейкоцитозом. Влияние экспрессии LRP на непосредственные результаты терапии отображено в табл. 2.

Таблица 2. Влияние экспрессии LRP на частоту достижения полной ремиссии (в %).

Ряд исследователей, например M. Schaich и соавт. [18], на больших группах больных (n=331) показывают отсутствие самостоятельного значения экспрессии LRP как прогностического фактора. Неоднозначность данных и достаточно большой накопленный материал привели к тому, что в последние годы большинство исследователей, занимающихся проблемой лекарственной устойчивости, оценивают комплексный фенотип МЛУ, т.е. экспрессию двух и более белков и влияние на исход лечения их ассоциаций. Например, H.J. Huh и соавт. [26] в 2006 г., проанализировав данные 81 больного, показали прогностическую значимость коэкспрессии MRP и MDR1, а также MRP и LRP для 2-летней выживаемости, подтвердив тем самым выводы ряда предшествовавших исследований. В последних работах показано, что у больных, бластные клетки которых экспрессируют 3 и более маркера МЛУ, шанс достижения полной ремиссии при применении стандартных методов лечения чрезвычайно мал.

Отделением химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН совместно с лабораторией генетики опухолевых клеток НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН впервые в России проводится комплексное исследование фенотипа МЛУ у первичных больных ОМЛ (кроме М3), изучение его влияния на частоту достижения полной ремиссии, а также на возможность преодоления неблагоприятного фенотипа при использовании различных антрациклинов в схемах индукционной химиотерапии. Мы определяли экспрессию гена MDR1, белков BCRP, LRP и MRP1 в бластных клетках костного мозга в первый острый период, а также во время рецидива. На настоящий момент в исследование включены 30 больных – 18 (58%) мужчин и 12 (42%) женщин с различными ФАБ-вариантами ОМЛ (табл. 3).

Таблица 3. Распределение больных по ФАБ-вариантам

Средний возраст пациентов составил 39,5 года (разброс 15–80 лет). У 22 больных перед началом лечения выполнено цитогенетическое исследование, в соответствии с которым больные были разделены на 3 прогностические группы (табл. 4).