Несмотря на огромный поток экспериментальных данных, некоторая ясность достигнута в понимании лишь отдельных звеньев Notch-сигнального пути. В последнее десятилетие предприняты шаги к объединению в единую систему полученных разрозненных фактов, но предлагаемые разными авторами модели могут в чем-то не совпадать. Наиболее полно Notch-путь, суть которого состоит в проведении сигнала с поверхности клетки в ядро, изучен во время эмбрионального нейрогенеза и формирования внешних сенсорных органов мухи. Согласно популярной обобщенной схеме, последовательность событий процесса латерального ингибирования на нейрогенном сигнальном пути начинается с генерации коротких ингибирующих сигналов клетками-предшественницами нейронов (рис. 1). Сигналы поступают в межклеточное пространство в виде секретируемых молекул лигандов Delta, которые воспринимаются близлежащими окружающими клетками. На клеточной поверхности воспринимающих сигнал и экспрессирующих рецептор клеток происходит взаимодействие внеклеточного домена лиганда Delta и трансмембранного рецепторного белка Notch. Белок рецептора состоит из трех доменов: внеклеточного, связывающегося с лигандом и подавляющего активность в отсутствие лиганда, внутримембранного и внутриклеточного, способного передавать сигнал к генам-мишеням. Молекула рецептора с измененной вследствие контакта с лигандом конформацией, подвергается расщеплению протеазами Kusbanian и Presenilin и, таким образом, отделению и активации его внутриклеточной части. Внутриклеточный домен Notch транспортируется в ядро и вместе с белком Suppressor of Hairless образует транскрипционный фактор, активирующий гены-мишени Enhancer of split complex. Накопление в отвечающей на сигнал клетке репрессорных белков E(SPL) – последняя ступень каскада Notch, на которой происходит подавление дифференцировки клеток по нейральному пути (Mumm, Kopan, 2000; Portin, 2002).
Нейрогенез начинается в пронейральных кластерах вентральной нейроэктодермы и процефалической области эмбриона. Обычно только 1 из 16 клеток каждого кластера превращается в нервную, остальные приобретают эпидермальный статус. Каждая клетка пронейрального кластера эктодермы экспрессирует ген achaеte-scute и имеет потенцию развития по нейральному пути. Каждая клетка кластера также синтезирует рецептор Notch и лиганд Delta и способна ингибировать и быть ингибируемой. Физиологические флюктуации концентраций этих белков внутри клеток усиливаются по цепи обратной связи, и клетки с высокой активностью Delta окружаются клетками с высокой активностью Notch. Молекулы белка Delta образуют гомо- и гетеротипические связи на поверхности клеток и конкурентно взаимодействуют с Notch. Связывание с Delta меняет конформацию Notch, делает его субстратом для протеаз и инициирует взаимодействие с другими белками (Heitzler et al., 1996).
Благодаря высокой степени сходства, известные рецепторы Noch-каскадов у C. elegans, дрозофилы, мыши, человека объединяют в семейство LIN 12/ Notch белков. Согласно данным секвенирования, ген Notch у Drosophila melanogaster кодирует белок, состоящий примерно из 3 000 аминокислот. Этот белок включает аминотерминальный гидрофобный лидер внеклеточного домена, богатый аргинином, характерный для сигнальных пептидов других белков, ассоциирующихся с мембраной. Еще более гидрофобная последовательность внутримембранной части белка, окруженная в определенном порядке гидрофильными остатками, тоже характерна для трансмембранных доменов известных, связывающихся с мембраной белков. Иммуноцитохимические методы анализа с использованием антител к разным частям белка в большинстве клеток выявляют Notch как долгоживущий, интегрированный с мембраной белок (Kidd et al., 1983; Wharton et al., 1985).
Рис. 1. Основные элементы Notch сигнального пути (По: Mumm, Kopan, 2000).
|
Рис. 2. Повторяющиеся мотивы в структуре Notch белка и сайтыего взаимодействия с другими белками (По: Arias, 2002).
|
Отличительная черта белка рецептора Notch – наличие трех мотивов повторяющихся последовательностей аминокислот. Два из них обнаружены во внеклеточном домене рецептора (рис. 2). Вслед за сигнальным пептидом располагается тандемный ряд повторенной 36 раз консервативной последовательности, напоминающей эпидермальный ростовой фактор млекопитающих (EGFL-повторы). Сразу за ним идет второй тандемный ряд из трех других богатых цистеином последовательностей, названных lin12/Notch-повторами. Биохимическими методами показано, что EGFL-повторы всегда располагаются на поверхности клетки, как и в других связывающихся с мембраной белках, и служат сайтами связывания с молекулами лигандов (Warton et al., 1985).
Внутриклеточная часть белка содержит 6 последовательных повторов мотива cdc10 (анкириновые повторы), который есть в последовательности цитоскелетного белка анкирина и в продукте гена cdc10 дрожжей. В районе между аминокислотами 2185 и 2300 выявлены три последовательности, напоминающие сайты связывания с фосфатами нуклеотидов у других известных белков. Далее район между 2637 и 2567 аминокислотами состоит из 30 глютаминовых остатков opa-повтора (strep-район). За ним следует С-терминальная последовательность PEST. Считается, что последовательности opa и PEST важны для регуляции стабильности белка (Warton et al., 1985).
Предполагается, что белок Notch – это димер, в котором цистеины внеклеточных EGFL-повторов образуют внутри- и межмолекулярные дисульфидные мостики, как в других подобных белках. Мутации в некоторых EGFL-повторах могут нарушать взаимодействие между полипептидными цепями Notch (Kheradmand, Werb, 2002).
В экспериментах с антителами к белку Notch показано, что он экспрессируется во время всего процесса развития в группах дифференцирующихся клеток: во время эмбриогенеза, начиная с бластулы, и далее в делящихся популяциях клеток на стадиях личинки, куколки и в половых клетках взрослой мухи. В вентральной нейрогенной области эктодермы эмбриона Notch сначала экспрессируется интенсивно и однородно, этим белком метятся предшественники нейробластов и эпидермобластов. Затем экспрессия становится дифференциальной, эпидермобласты показывают более высокий уровень содержания белка (Kidd et al., 1989; Artavanis-Tsakonas et al., 1995).
Внутриклеточная часть Notch-белка после удаления внеклеточного домена обладает нерегулируемой трансдуктивной активностью и локализуется преимущественно в ядре, в отличие от белка дикого типа, экспрессия которого наблюдается преимущественно на поверхности клеток. Экспрессия такой формы Notch в эмбрионах на стадии развития ЦНС и в имагинальных дисках во время формирования сенсорных органов, подобно мутациям с повышенной функцией, подавляет детерминацию нейробластов, и все нейроэктодермальные клетки превращаются в эпидермальные (Struhl, Adachi, 1998). Трансформанты, несущие делеции EGFL-повторов или всей внеклеточной части, по фенотипу также напоминают мутации Notch с повышенной функцией. Делеции всей внутриклеточной области Notch-белка дают фенотип, характерный для нуль-мутаций – грубые глаза, потерю микрохет на тораксе, вырезки на крыльях (Rebay et al., 1993).
Достаточно хорошо изучен трансмембранный белок лиганда Delta. Он тоже обнаруживается в разных тканях эмбриона, в том числе во всех клетках пронейральных кластеров, крыловом диске. В нем выделяют N-сигнальный терминальный участок, необходимый для транспорта через мембрану, большой внеклеточный домен с девятью повторами EGF-подобного фактора и относительно короткий внутриклеточный домен. В культуре шнейдеровских клеток (S2) методом иммунофлюоресцентного специфического к внеклеточному домену белка окрашивания показана локализация Delta на клеточной поверхности. На поверхности клеток S2 после одновременной трансфекции конструкциями, включающими оба гена, Notch и Delta, наблюдается сходство в распределении Delta и Notch. Коиммунопреципитация к белковым экстрактам из таких S2 клеток и клеток эмбрионов показывает, что Notch и Delta образуют прочный межмолекулярный комплекс. Все это верно не только в случае экспрессии в клетках полной последовательности, но и в случае экспрессии части Notch с почти полностью удаленным внутриклеточным доменом (Doherty et al., 1996). Полученные данные о структуре и клеточной локализации Notch и Delta, их взаимодействии in vitro, функциональных особенностях разных доменов белков дают основания для построения схемы взаимодействий компонентов каскада и понимания механизмов передачи сигнала с поверхности клетки в ядро.
Белок лиганда Serrate играет сходную, но комплементарную роль с Delta в крыловом диске. Они действуют как компартмент-специфические лиганды на дорзовентральной границе во время роста крыловой пластины и формирования края крыла: Serrate – в дорзальном, а Delta – в вентральном отделах связывают одни и те же EGFL-повторы Notch. Структура последовательности белка лиганда Ser обнаруживает большое сходство с Dl, имея сигнальный пептид, 14 повторов EGF-подобного фактора в ее внеклеточном районе, внутримембранный домен и совсем маленькую внутриклеточную часть. Экспрессия трансмембранного белка Ser обнаруживается в области формирования края крыла в имагинальном диске (Fleming et al., 1990). Показано, что клетки S2, экспрессирующие Ser, образуют агрегаты с клетками, экспрессирующими Notch (Speicher et al., 1994). В обобщенных для разных животных схемах пути Notch сходные по структуре и функции белки Delta и Serrate у Drosophila melanogaster и Lag2 у C. elegans объединяют в одно семейство DSL трансмембранных лигандов.
Усилиями многих исследовательских групп за последнее десятилетие показано, что под воздействием связывания с лигандами изменяется конформация белка рецептора Notch, и он становится субстратом для различных протеаз. Металлопротеазы из семейства ADAM расщепляют рецептор во внеклеточном домене, оставляя в его молекуле 11–12 аминокислот от внеклеточного домена. Внутриклеточный домен после этого остается прикрепленным к клеточной мембране. Относительно недавние данные позволяют связывать такое расщепление рецептора Notch у Drosophila melanogaster с металлопротеазой Kuzbanian (Lieber et al., 2002). Есть и другие мнения о роли в цепи передачи Notch-сигнала трансмембранного белка Kuzbanian. Одни считают вероятным его участие в протеолизисе внеклеточной части Notch-белка на стадиях созревания рецептора и продвижения его к клеточной мембране, необходимых для взаимодействия Notch-рецептора с лигандами. Образующийся после этого посредством дисульфидных мостиков димер Notch теряет внутреннюю часть EGF-повторов во внеклеточном домене (Pan, Rubin, 1997). Другие предполагают, что Kuz на поверхности секретирующих клеток участвует в процессинге Delta, свобождающем его внеклеточный домен для связывания с Notch (Qi et al., 1999). Характер генетических взаимодействий kuz и N, Ser, E(spl)m8 и H, позволил предположить, что трансмембранный Kuz участвует в цепи передачи Notch-сигнала на стадии, предшествующей Su(H). Kuz экспрессируется в эмбриональной нейроэктодерме и личиночном глазном имагинальном диске.
На следующем этапе процессинга рецептора наблюдается расщепление во внутримембранном домене белка или в непосредственной близости от мембраны. На основании полученных на сегодняшний день данных лучшим кандидатом на участие в этом внутримембранном расщеплении считается фермент Presenilin (PS). Известно, что белки PS и Notch физически ассоциируют между собой и образуют комплекс в клеточной мембране (Ray et al., 1999). Иммуноокрашивание PS– и нормальных глазных дисков показывает, что субклеточная локализация и распределение Notch и Delta y них примерно одинаковы. В то время как уровень Notch-белка и его локализация в клеточной мембране у PS–-эмбрионов не отличается от дикого типа, транспорт внутриклеточной части Notch в ядро зависит от генотипа по PS. Использование конструкций с сигнальными генами показало, что активированная форма Nint, в которой делетированы внеклеточная и трансмембранная части белка, достигает ядер в отсутствие активности PS. Белок NEGF, в котором удален только внеклеточный район, не накапливается в ядрах PS–-эмбрионов (Ye et al., 1999; Mumm, Kopan, 2000; Struhl, Greenwald, 2001). В результате контролируемого ферментом PS протеолизиса в районе внутримембранного домена внутриклеточная часть белка Notch освобождается от мембраны и приобретает способность передвигаться и доставлять сигнал в ядро (Struhl, Adashi, 1998; Mumm, Kopan, 2000). В свою очередь, экстраклеточный домен белка Notch подвергается транс-эндоцитозу в клетках, экспрессирующих лиганд (Parks et al., 2000).
Активированный внутриклеточный домен белка рецептора Notch при участии анкириновых сdc10 повторов связывается с регуляторами транскрипции группы CSL (CBF1, Su(H), Lag-1), к которым относится Su(H) у Drosophila melanogaster. Белок Su(H) в культуре клеток S2, несущих конструкцию с полноразмерной копией Su(H), локализуется преимущественно в ядре. После одновременной трансфекции в S2 полноразмерных копий генов Su(H) и Notch белки Su(H) и Notch обнаруживаются в цитоплазме с одинаковой вариацией их относительных уровней в различных частях клетки. В случае когда трансфекция выполнена с использованием последовательности Notch-локуса, делетированной по сdc10-району, колокализация белков не наблюдается и Su(H) первоначально концентрируется в ядре. В системе трансформированных дрожжей полноразмерный белок Su(H) ассоциируется с внутриклеточным сегментом Notch, если только он содержит все 6 cdc10-повторов. В смешанной S2 культуре, когда клетки, экспрессирующие Su(H) и Notch, агрегируют с клетками, экспрессирующими Dl, цитоплазматическая локализация Su(H) и Notch меняется на ядерную
В отсутствие активности внутриклеточного домена Notch белок Su(H) в агрегате с комплексами корепрессоров выступает в роли репрессора транскрипции генов. Notch действует как антагонист этого объединения. Связываясь в цитоплазме или ядре с корепрессорами и с Su(H), Notch вызывает каскад взаимодействий Su(H) с рядом других белков и переключение Su(H) на роль активатора транскрипции (Mumm, Kopan, 2000).
В ядре Su(H) запускает гены-мишени комплекса E(spl), белки которых вместе с продуктами генов-мишеней Notch-пути у разных животных объединены в класс HES (от Hairy и E(spl)). В опытах с последовательностями Su(H) разной длины определена примерная протяженность области белка, необходимая для связывания с ДНК. Способность Su(H) распознавать сайт связывания ДНК теряется после образования белок-белкового комплекса Н-Su(H). Обнаружен участок Su(H) для прямого взаимо-действия с Н in vitro. Увеличение in vitro концентрации Н коррелирует с ослаблением связывания между Su(H) и ДНК, когда их количество не меняется (Brou et al., 1994; Barolo et al., 2002).
Белки 7 нейрогенов комплекса E(spl) содержат bHLH-мотивы, способные к образованию гомо- и гетеродимеров и к связыванию со специфическими последовательностями ДНК. Их относят к группе негативных регуляторов транскрипции. Транскрипты E(spl) экспрессируются в определенной динамике в эмбриогенезе и на личиночных и куколочных стадиях. Нейрогенные локусы комплекса транскрибируются в нейроэктодерме, в крыловом имагинальном диске в местах будущего формирования сенсорных органов, вблизи дорзовентральной границы крыла, в местах формирования жилок пластины крыла, во всей морфогенетической бороздке глазного диска, в яичниках взрослой самки (Knust et al., 1987). С потерей функции Notch или Delta нарушается нормальная аккумуляция белков E(spl)bHLH в ядрах клеток вентральной нейроэктодермы (Jennings et al., 1994).
Каскад событий Notch-сигнального пути завершается включением E(spl). В свою очередь, белки-репрессоры E(spl)bHLH предотвращают клетки в пронейральных кластерах эктодермы от развития по нейральному пути, ингибируя пронейральные гены achaete, scute, lethal of scute (Jennings et al., 1994; Heitzler et al., 1996).
Аналогично действию в нейрогенезе Notch-путь контролирует судьбу недифференцированных бипотентных клеток-предшественниц в оогенезе. Напротив, во время развития крыла и глаза Notch-путь может выполнять не ингибирующую, а индуктивную функцию (Mumm, Kopan, 2000; Portin, 2002).