Станции и племпредприятия по искусственному осеменению широко применяют метод замораживания и длительного хранения спермы быков в жидком азоте при температуре -196ºС. В таком состоянии сперму можно хранить в течение многих месяцев или нескольких лет без потери оплодотворяющей способности. Для замораживания и хранения спермы используют специальные аппараты и стационарные хранилища. Из хранилищ сперму транспортируют в обслуживаемые хозяйства в сосудах Дьюара различного объёма. Сперму быков используют для замораживания с концентрацией спермиев не менее 0,7млрд. в 1мл и активностью спермиев не ниже 8 баллов. Сперму замораживают в гранулах на фторопластовой пластине, в облицованных гранулах и в полипропиленовых соломинках (пайеттах).
Замораживание спермы в форме гранул на фторопластовых пластинах. После получения и оценки сперму быков разбавляют лактозо-желточной средой с глицерином. Перед разбавлением среду подогревают до 30-35ºС. Сперму разбавляют в 2, 10 раз и более в зависимости от объёма гранул. Если применяют гранулы спермы объёмом по 0,1-0,2мл, то для них требуются меньшие степени разбавления. На пункте искусственного осеменения такие гранулы разбавляют. Для этого их оттаивают во флаконе с 1мл 2,9%-ного раствора цитрата натрия, подогретого до t =38-40ºC.
Для замораживания спермы в гранулах объёмом 0,5 мл сперму разбавляют в 10 раз и более. Эти гранулы перед осеменением коров не разбавляют. Для осеменения коров берут две данные гранулы, помещают в стерильный флакон или пробирку и погружают флакон в теплую воду (38-40ºC) для оттаивания гранул.
Для замораживания в гранулах сперму после разбавления охлаждают до t =2-5ºC в течение 3-4ч., а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. После разлива пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5-10см в течение 1,5-2мин., а затем погружают её в жидкий азот на 1-2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранулы собирают в сачок или контейнер, затем пересыпают их в холажденный контейнер, который помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. В таких сосудах гранулы хранят и на пунктах искусственного осеменения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением гранулы из чашек достают охлажденным до -196ºС пинцетом, оттаивают их, оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности спермиев не ниже 4 баллов.
Замораживание спермы в облицованных гранулах (по Осташко). По этому методу для замораживания используют свежеполученную сперму, разбавленную средами №1 и №2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые ёмкости по 200-400мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления спермы.
После получения спермы её разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5-10мин. Затем разбавляют сперму средой №2 до требуемой концентрации (15 млн. в дозе).
Разбавление производят с помощью специального устройства, позволяющего дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприёмника со спермой. Спермоприёмник соединяют с тонкостенной полимерной трубкой диаметром 3,8-4мм, с толщиной стенки 120мкм и выдавливают в неразбавленную сперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на отдельные дозы по 0,25-0,33мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые тубы, которые закрывают поролоновыми пробками и закрепляют в обоймы специального устройства для эквшибрации и замораживания спермы. Это устройство помещают в холодильник для охлаждения до 2-5ºС. После 4-6-часовой выдержки при данной температуре обойму аппарата с тубами погружают в ёмкости с жидким азотом на 8-10мин., а затем полностью погружают в него до проверки качества спермы.
Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24ч. Из каждой тубы берут по одной грануле и помещают их в воду температурой 40ºС для оттаивания. Упаковку гранулы вытирают марлевой салфеткой, с помощью ножниц вскрывают ее и определяют активность спермиев. После проверки активности для дальнейшего хранения в жидком азоте допускают сперму с активностью не ниже 4 баллов. После проверки при хорошем качестве спермы тубы закрывают поролоновыми пробками, отсоединяют от обоймы и помещают в хранилище с жидким азотом для хранения.
Замораживание спермы в соломинках (пайеттах). При замораживании используют полипропиленовые трубочки ёмкостью 0,25 мл. Сперму разбавляют лактозо-фруктозо-раффинозо-магниево-глицерино-желточной средой (ЛФРМГЖ) с таким расчетом, чтобы в пайетте содержалось после оттаивания не менее 15 млн. подвижных спермиев. Каждую пайетту маркируют с указанием наименования предприятия, клички и номера быка, даты получения спермы. После разбавления сперму расфасовывают по 0,25мл. Для этого используют машину, которая автоматически наполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками. Один шарик используется как пробка-поршень, а другой герметизирует соломинку.
Соломинки после наполнения их спермой раскладывают на штатив с зубцами посредством счетных реек с 125 пазами. Счетную рейку заполняют соломинками легким движением ладони руки. Потом штатив снимают с рейки, между зубцами штатива размещаются соломинки. Штативы с соломинками кладут в пластмассовые коробки, которые ставят для охлаждения в холодильник при температуре 4ºС на 3-4ч. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и для замораживания допускают сперму с оценкой не ниже 8 баллов. Сперму замораживают в газообразном азоте на медном сите в стационарном хранилище КВ-6202 при t= -120-130ºС в течение 5 мин. Замороженную сперму в соломинках помещают в пластмассовые стаканы, в которые входит до 500 шт., и хранят в стационарном хранилище в жидком азоте при температуре -196ºС.
Для осеменения берут сперму не раньше 14-20 дней после замораживания.
На пункты искусственного осеменения замороженную сперму быков доставляют в хозяйства 2-4 раза в год и используют её по мере надобности. Раз в месяц необходимо пополнять сосуды жидким азотом, в которых хранится сперма. Нельзя преждевременно оттаивать сперму или повторно её замораживать.
Высокая оплодотворяемость животных при искусственном осеменении обеспечивается при использовании только высококачественной спермы. Поэтому перед каждым осеменением животных необходимо проводить тщательную проверку её качества.