Остро стоящий вопрос экологической ситуации, современные разработки новых поколений антисептиков, широкое применение антибиотиков в медицине, в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, небрежное использование антибактериальной терапии, всё это ведет к модификации бактерий и появления у них новых факторов патогенности.
Среди многообразия микромира, выделенная и описанная более ста лет назад синегнойная палочкаявляется серьезной проблемой в различных областях жизни и по настоящее время.
Ключевые слова: Pseudomonas аerugenosа, питательные среды.
Pressing ecological problems, modern researches of new generations of antiseptics, widespread usage of antibiotics in medicine, food industry, agriculture, carelessness usage of antibacterial therapy, all in all, causes bacteria modifications and their new pathogenic power.
Among the variety of the microcosm, isolated and described over one hundred years ago Pseudomonas aeruginosa infection is a serious problem in various fields of life to the present.
Key words: Pseudomonas аerugenosа, culture medium.
Семейство Pseudomonadaceae, к которому относится P.aeruginosa, включает свободноживущие грамотрицательные палочки — неферментирующие бактерии, которые обитают преимущественно в почве и воде и имеют ограниченное клиническое значение в патологии человека. В отличие от большинства представителей данного рода, синегнойная палочка является основным возбудителем псевдомонадных инфекций у человека и входит в состав его нормальной микрофлоры [3].
Характерной биологической особенностью синегнойной палочки является ее способность вырабатывать пигменты. Различают культуры, продуцирующие синий пигмент пиоцианин и желто-зеленый флуоресцин. Некоторые штаммы, кроме того, выделяют желтый пигмент - гемопиоцианин, красный - пиорубин и черный - меланин. Культуры также имеют специфический запах, напоминающий запах цветущей липы. Синегнойная палочка обладает сравнительно слабой сахаролитической активностью. Имеет достаточно выраженные протеолитические свойства. Она легко приспосабливается к большинству антибиотиков, устойчива даже к очень высоким их концентрациям. Патогенна для человека [5].
Излюбленным местом обитания синегнойной палочки являются бассейны, где в межплиточном пространстве они создают целые колонии. Способность к образованию биопленок (колония синегнойных палочек формирует сплошной пласт, покрытый биополимером, который способен надежно защитить их от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды) и способность сохраняться в воде до 1 года при температуре 37°С, создает целый спектр проблем в этой области.
Целый ряд особенностей позволяет синегнойной палочке также лидироватьпочастотевозникновения и внутрибольничныхинфекций.
Основная опасность кроется в факторах патогенности синегнойной палочки:
· подвижность за счет жгутиков;
· способность выработки токсинов (эндотоксин, экзотоксин, эндогемолизин, фермент лейкоцидин), которые вызывают поражение эритроцитов, клеток печени, запуск интоксикации, гибель лейкоцитов в очагах;
· высокая устойчивость к ряду антибактериальных средств за счет способности образовывать вокруг своих колоний слизеподобную капсулу - гликокаликс (в частности, устойчива к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхинолонам), что затрудняет эффективность лечебных мероприятий у таких больных [8].
· способность к неспецифической адгезии – бактерия обладает свойством прикрепляться к небиологическим объектам: катетерам, трубкам аппарата искусственной вентиляции легких, эндоскопам, хирургическим инструментам [9].
Все эти факторы создают необходимость лабораторного контроля больничных учреждений, а также контроля в области производства продуктов питания, лекарственных препаратов, косметической продукции и др. объектов в санитарной и клинической микробиологии
Синегнойная инфекция характеризуется отсутствием клинически специфических симптомов, что значительно затрудняет постановку предварительного диагноза и окончательный диагноз выставляется только после лабораторного обследования. Корректная идентификация P. aeruginosa и родственных микроорганизмов обусловлена, в первую очередь, различиями в их природной чувствительности (устойчивости) к антибиотикам [4]. Ведущим методом диагностики является бактериологический с последующей бактериоскопией.
Метод выявления бактерий вида P.aeruginosa при лабораторной диагностике на первом этапе включает предварительное обогащение в неселективной среде. Для этой цели используются различные питательные бульоны.
В ФБУН ГНЦ ПМБ выпускаются различные питательные среды для накопления и идентификации псевдомонад. Так, питательная среда № 8 ГРМ предназначена для выращивания синегнойной палочки и стафилококков при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и других объектов, а также при проведении исследований в санитарной и клинической микробиологии.
Характерной особенностью бактерий P. aeruginosa является образование слизи. В связи с этим на жидких средах образуется особая серовато-серебристая пленка. При старении культур происходит образование мути с последующим выпадением слизистого осадка. (Рисунок 1).
Рис. 1 - Pseudomonas aeruginosa на Питательной среде № 8 ГРМ
(ФБУН ГНЦ ПМБ)
В качестве питательной среды для культивирования различных неприхотливых микроорганизмов, в том числе и синегнойной палочки, используется ГРМ-агар. Рост тест-штамма P. aeruginosa 27/99 на ГРМ агаре сопровождается образованием сине-зеленого пигмента через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1) °С. (Рисунок 2).
Рис.2 – Рост P. aeruginosa 27/99 на ГРМ-агаре (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Большинство штаммов синегнойной палочки производит пигмент пиоцианин, имеющий сине-зеленый цвет. Для выявления пигмента пиоцианина у синегнойной палочки при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств, а также при проведении исследований в санитарной и клинической микробиологии используют среду № 9-ГРМ [2]. (Рисунок 3).
Рис.3 – P. aeruginosa на среде № 9 производства ФБУН ГНЦ ПМБ
На плотных питательных средах она диссоциирует на три формы – R-,S-, и M- формы, которые продуцируют характерные пигменты: - пиоцианин(феназиновый пигмент сине-зеленого цвета, пиовердин –желто-зеленый флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах и пиорубин – бурого цвета).
Рост псевдомонад на питательных средах ФБУН ГНЦ ПМБ вызывает интерес своим разнообразием.
1. На среде Плоскирева –ГРМ рост P. aeruginosa 453 наблюдается в виде мелких жемчужного цвета колоний, а на среде с эозин-метиленовым синим (среда Левина) P. aeruginosa 27/99образует крупные розового цвета колонии. (рисунок 4 и 5)
| Рис. 4 Рост P. aeruginosa 453 на агаре Плоскирева-ГРМ ФБУН ГНЦ ПМБ | Рис. 5 Рост P. aeruginosa 27/99 на среде Левина-ГРМ ФБУН ГНЦ ПМБ |
2. На среде Эндо тест-штамм P. aeruginosa 27/99 и на Хромагаре тест-штамм P. aeruginosa 453 соответственно образуют бесцветные непрозрачные в R- и S- форме колонии (рисунок 6 и 7)
| Рис.6. Рост P. aeruginosa 27/99 на агаре Эндо-ГРМ ФБУН ГНЦ ПМБ | Рис. 7. Рост P. aeruginosa 453 на Хромагаре ФБУН ГНЦ ПМБ |
3. На лактозном ТТХ агаре с тергитолом 7 тест-штамм P. aeruginosa 27/99 образует крупные красно-коричневого цвета с неровным краем и с синей зоной колонии, а тест-штамм P. aeruginosa АТСС 9027 в виде мелких круглых, красно-коричневого цвета с синей зоной колоний. (Рисунок 8).
Рис. 8. Рост P. aeruginosa 27/99 и P. aeruginosa АТСС 9027 на лактозном ТТХ агаре с тергитолом 7 ФБУН ГНЦ ПМБ
Диссоциация бактериальных клеток P. аeruginosa, возникающая спонтанно и характеризующаяся образованием отличающихся друг от друга колоний,наблюдается на различных плотных дифференциально-диагностических средах.
Так, P. aeruginosa 453на плотных средах формирует типы колонийR, S и М-формы (Рисунок9).
Рис. 9 – Рост P. аeruginosa 453на кровяном агаре и среде Левина-ГРМ
На плотных средах у синегнойной палочки может наблюдаться феномен радужного лизиса – появление на поверхности колоний плёнки, переливающейся всеми цветами радуги в отражённом свете (Рисунок 10). [7].
Рис. 10 - феномен радужного лизиса P. aeruginosa
В бактериологической практике выделение типичных колоний и подтверждение их принадлежности к бактериям вида P. aeruginosa на агаризованной селективно-диагностической питательной среде проводят после предварительного обогащения исследуемого материала в неселективной среде с последующим подтверждением по отношению к окраске по Граму, присутствию оксидазы, образованию пигментов и по биохимическим признакам [1].
В качестве селективных питательных сред чаще используют среды с ингибиторами: цетримидом и триклозаном.
В ФБУН ГНЦ ПМБ разработана Селективная питательная среда с цетримидом (Цетримидный агар) для выделения P. aeruginosa из клинического материала, объектов внешней среды, пищевых продуктов и др. [6]. Патент: RU 2530549. Питательная среда обеспечивает рост P. aeruginosa с соответствующим пигментом. Рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий в значительной степени ингибируется.
Ведущими зарубежными фирмами выпускаются питательные среды с цетримидом на основе желатина, мясного пептона и лактозы, а также содержащие калий сернокислый, магний хлористый, цетримид, агар, налидиксовую кислоту и глицерин. В Цетримидном агаре в качестве белковой основы используется панкреатический гидролизат казеина, выпускаемый в НПО ПС, а дополнительно внесенный дрожжевой экстракт в состав питательной среды, содержащий витамины группы В, стимулирует оптимальные условия роста псевдомонад.
При разработке Цетримидного агара магний хлористый заменен на магний сернокислый, что в присутствии фосфатов калия приводит к усилению образования пигмента(рисунок 11). Кроме того, замена калия сернокислого на одно- и двузамещенные фосфаты калия улучшает дифференцирующие свойства за счет поддержания буферной емкости среды.
Для усиления ингибирующего эффекта в отношении сопутствующей микрофлоры в состав питательной среды дополнительно внесена налидиксовая кислота.
Рис.11 – Рост P. aeruginosa 27/99 на селективной питательной среде для выделения псевдомонад (Цетримидный агар) ФБУН ГНЦ ПМБ
Ввиду значимости синегнойной палочки как патогенной для человека и способной занимать различные экологические ниши, при разработке питательных сред для выделения и идентификации микроорганизмов,
P. aeruginosa используется как один из важных контрольных тест-штаммов.
Синегнойная палочка обладает низкой сахаралитической активностью, она не ферментирует глюкозу и другие углеводы, но способна их окислять для получения энергии.
Тест-штамм P. aeruginosa 453 не ферментирует углеводы, не выделяет сероводород, поэтому на трехсахарном агаре с солями железа – питательной среде для выявления сероводорода и определения ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы (Питательная среда № 13 ГРМ), рост сопровождается образованием пигмента в виде серого налета на поверхности скошенной части среды без изменения цвета среды. (рисунок 12)
Рис.12 – Слева направо: рост тест-штамма P. aeruginosa 453 на питательной среде для контроля микробной загрязненности (Питательная среда № 13 ГРМ) ФБУН ГНЦ ПМБ, контроль (незасеянная пробирка).
Лечение синегнойной инфекции проводится антибактериальными препаратами после определения чувствительности к ним возбудителя.
С целью определения терапевтической схемы лечения инфекционных болезней и характеристики штаммов, используется агар Мюллера-Хинтон или питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
(Рисунок 13).
Рис.13 – Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом, слева направо: Агар Мюллер-Хинтон, Питательная среда для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам производства ФБУН ГНЦ ПМБ.
Диаметры зон задержки роста вокруг дисков с антибактериальными препаратами, удовлетворяют требованиям клинических рекомендаций по определению чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам 2014 г и EUCAST.
Таким образом, ФБУН ГНЦ ПМБ производит полный набор питательных сред для выявления бактерий P. аeruginosa методом бактериологического исследования, изучения культуральных и морфологических признаков, а также пигментообразования и определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
Использование вышеуказанных питательных сред позволит решить задачу не только успешного выявления синегнойной инфекции, но и своевременное и эффективное назначение антибактериальной терапии.
Список используемой литературы
1. ГОСТ Р 54755-2011. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa
2. МУК 4.2.2942-11. Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях.
3. Илюкевич Г.В. Синегнойная инфекция: в новый век со старой проблемой. /Г.В. Илюкевич // «Медицинские новости» – 2004. – №12. – С. 3-8
4. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности Кафедра микробиологии и клинической химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования, Государственный научный центр по антибиотикам, Москва. Антибиотики ихимиотерапия, 1999-N3, стр. 25-34
5. МР Методические рекомендации по бактериологической диагностике синегнойной инфекции. М. 1984. С. 5.
6. Патент: RU 2530549 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) / Храмов Михаил Владимирович, Шепелин Анатолий Прокопьевич, Полосенко Ольга Вадимовна, Марчихина Ирина Ивановна, Шолохова Любовь Петровна, Мартовецкий Михаил Николаевич.
Интернет источники:
7. Псевдомонады. РодPseudomonas. Синегнойная палочка. Эпидемиология синегнойной палочки. Распространённость синегнойной палочки. [Электронный ресурс],-https://meduniver.com/Medical/Microbiology/ MedUniver
8. Быкова Н.И. Синегнойная палочка (синегнойная инфекция). [Электронный ресурс], - https://www.medicalj.ru - статья
9. Синегнойная палочка: как передается, чем опасна, клиника. [Электронный ресурс],- https://uhonos.ru/infekcii/vnutribolnichnaya