a-Амилазы действуют на a-1,4 –гликозидные связи, расщепляют амилозу внутри её цепи, в результате чего с большой скоростью образуются низкомолекулярные продукты гидролиза – нормальные a-декстрины. Их дальнейший гидролиз даёт мальтозу, мальтотриозу и глюкозу. Было найдено, что расщепление a-1,4-глюкозидных связей в амилозе носит случайный характер иподчиняется закону статистического распределения продуктов реакции. Расщепление более мелких фракций на последнем этапе амилоза носит уже не случайный характер – действие фермента направлено лишь на определённые a-1,4-гликозидные связи. В конечном счёте a-амилазы превращают амилозу в мальтозу и глюкозу, хотя и отмечены некоторые несущественные различия в динамике гидролиза этими ферментами указанного субстрата.
Бендецкий, Яровенко по изменению вязкости и восстанавливающей способности гидролизатов крахмала оценивали действие (множественность атаки) a-амилазы Bac. Subtilis на растворимый крахмал. Авторы наблюдали существенное различие вязкость –восстанавливающая способность при кислотном и ферментативном гидролизе крахмала. Это дало основание сделать заключение, что при кислотном гидролизе деградация крахмала происходит беспорядочно, а при действии a-амилазы осуществляется множественная атака на субстрат, приводящая к образованию олигомеров на первой стадии деградации.
Разрыв цепей амилопектина осуществляется между a-1,6 - глюкозидными связями. Отщепление декстринов, содержащих 15 и более гликозидных остатков, идёт с большей скоростью, в то время как конечное осахаривание существенно замедляется. Продукты гидролиза, содержащие a-1,4 - глюкозидные связи, являются нормальными a-декстринами и состоят из 6-13 глюкозидных остатков. Остаточные декстрины, содержащие большое количество a-1,6-связей, обазначаются как аномальные конечные декстрины. Установлено, что a-1,6-связи не только не расщепляются a-амилазой, но и являются стерическим препятствием для гидролиза a-1,4-связей, находящихся в непосредственной близости к a-1,6-связям. Наименьшим предельным декстрином в конце гидролиза амилопектина амилазой слюны был найден тетрасахарид, солодовой амилазы – паноза, т. е устойчивым к расщеплению в первом случае были две a-1,4-глюкозидные связи, во втором – лишь одна.
На рис. Представлена схема действия a-амилаз на амилозу и амилопектин по Бернфельду.
Рис.2 Действие a-амилазы на амилозу и амилопектин по Бернфельду.1 – мальтоза; 2 – глюкоза; 3 – нормальный a-декстрин; 4 – конечный a-декстрин; *-редуцирующий конец амилозы или амилопектина; - действие a-амилазы.
Ход работы
Оборудование: электрическая плитка, химические стаканы, колбы, термостойкая колба, термометр, водяная баня, пипетка, мензурка.
Реактивы: крахмал, раствор йода.
Приготовление раствора крахмала:
В термостойкую колбу добавляем 200 мл воды. В неё же добавляем 2 г крахмала. Доводим смесь до кипения и кипятим несколько минут. Таким образом получаем 1% раствор крахмала.
Приготовление раствора слюны:
50 мл воды полощем во рту в течении 3-4 минут.
Проведение эксперимента:
В три пробирки добавляем по 25 мл раствора крахмала и каплю йода. Раствор крахмала окрашивается в интенсивно синюю окраску. Нагреваем электрическую плитку и измеряем температуру водяной бани. В течении 8-10 минут даём время, чтобы температура водяной бани и температура раствора в пробирках уравнялась. Снова измеряем температуру водяной бани. Добавляем в раствор крахмала 5 мл раствора слюны и включаем секундомер. Отмечаем время исчезновения синей окраски. Затем в следующие три пробирки добавляем раствор крахмала и каплю раствора йода, охлаждаем водяную баню и повторяем процедуру при более низкой температуре.
Результаты эксперимента приведены в таблице:
| toC | ||||||||
| t1 | 11 мин 17 с | 7 мин 5с | 3 мин 56 с | 3 мин 16 с | 4 мин 6 с | 5 мин 13 с | 6 мин 57 с | |
| t2 | 11мин 22 с | 7 мин 13с | 4 мин 6 с | 3 мин 23 с | 4 мин 16 с | 5 мин 5 с | 6 мин 55 с | |
| t3 | 11 мин 23 с | 7 мин 9с | 4 мин | 3 мин 21 с | 4 мин 8 с | 5 мин 11 с | 7 мин 3 с | |
| tср. | 11 мин 21с | 7 мин 9 с | 4 мин 1 с | 3 мин 20 с | 4 мин 10 с | 5 мин 10 с | 6 мин 58 с | |
| toC | ||||||||
| 1/t мин-1 | 0.088 | 0.14 | 0.25 | 0.3 | 0.24 | 0. 195 | 0.143 | |
Зависимость скорости расщепления крахмала от температуры.
Можно видеть, что кривая имеет колокообразный характер с максимумом при температуре 37оС. Это подтверждает белковое строение a-амилазы, так как при использовании неорганических катализаторов скорость при повышении температуры постоянно возрастает. Также можно видеть, что в нейтральной среде оптимальная работа фермента происходит при 37оС, что совпадает с температурой тела человека.
Литература
1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. «Руководство к практическим занятиям по биологической химии». М.: Высшая школа 1988 г.
2. Жеребцов Н.А. «Амилолитические ферменты в пищевой промышленности». М.: Лёгкая и пищевая промышленность 1984 г.
3. А. Ленинджер «Биохимия». 1976 г.
4. Лещук Р.И., Хило З.В. «Малый практикум по биохимии». Томск 1984 г.
5. Производство и применение амилолитических ферментов в пищевой промышленности. М.: Пищевая промышленность 1968 г.
6. Филиппович Ю.Б. «Основы биохимии». М.: Высшая школа 1985 г.
Благодарности
Выражаю благодарность учителю физики Барановой Елене Львовне за помощь в работе и за предоставленное оборудование, ученику 9б класса Косареву Славе за оформление плакатов и ученице 11а класса Овчаровой Наталье за помощь в работе.