А. Бактериологический (по классической схеме с последующей
биологической пробой – см. ниже).
Б. Биологический
Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.
Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А, В, С, Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.
При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.
В. Ускоренные методы диагностики ботулизма
а) обнаружение токсина с помощью РПГА (на эритроцитах адсорбируют антитоксин)
б) обнаружение токсина с помощью реакции угнетения фагоцитоза. Ботулинический токсин резко угнетает фагоцитарную способность лейкоцитов в связи с наличием у токсина лейкотоксических свойств. При этом фагоцитарный показатель уменьшается в 3, 5, 10 и даже 20 раз. При добавлении к крови, содержащей токсин, гомологичной антитоксической сыворотки фагоцитарная способность лейкоцитов восстанавливается.
ЗАНЯТИЕ № 11
Дата________________
Тема: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ (газовая анаэробная инфекция)
План занятия
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.
4. Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде.
5. Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
Методические указания
1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.
Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.
2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.
Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Китта-Тароцци, Вильсон-Блера, Цейсслера, на молоке.
3. Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики газовой гангрены.
Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.
Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 мин для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Китта-Тароцци. Пастеровской пипеткой взять каплю гноя и, наклонив пробирку со средой Китта-Тароцци, по верхней стенке осторожно ввести каплю гноя на дно пробирки так, чтобы не попал воздух.
Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.
4. Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде.
Посев раневого отделяемого на среду Вильсон-Блера. Среда Вильсон-Блера предварительно расплавляется и выдается студентам в пробирках. Перед посевом ее необходимо охладить до температуры 40-45°С. Раневое отделяемое предварительно развести в стерильном физиологическом растворе. Для этого каплю исследуемого материала внести в пробирку с физиологическим раствором. Затем после перемешивания из этой пробирки каплю внести в пробирку со средой Вильсон-Блера, тщательно перемешать путем вдувания и выдувания содержимого и быстро набрать среду в трубки Вейон-Виньяля. Трубки положить в горизонтальном положении и дать им остыть. Концы трубок закрыть ватой.
6. Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.
| Рис.1. С. реrfringens Окраска по Граму | Рис.2. Анаэробы в раневом отделяемом Окраска по Граму | Рис.3. С. novi Окраска по Граму |
Контрольные вопросы
1. Каковы основные биологические свойства анаэробных бактерий?
2. Какова роль анаэробных бактерий в патологии человека?
3. Какие заболевания вызывают анаэробные бактерии?
4. Каков механизм заражения при газовой гангрене?
5. Что является средой обитания анаэробных бактерий в естественных условиях?
6. Какие возбудители чаще всего вызывают газовую гангрену?
7. Какие токсины образуют возбудители газовой гангрены и на что они действуют?
8. Каковы особенности патогенеза газовой гангрены?
9. Какие условия способствуют развитию газовой гангрены?
10. По каким основным признакам различаются между собой C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum?
11. Какие ускоренные методы применяются для обнаружения C. perfringens?
12. Какие микробиологические методы используются для диагностики анаэробных инфекций?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ 11