Систематика микроорганизмов данного рода не завершена и требует дальнейшей доработки. Достаточно указать, что по справочнику Берджи (1997 г., издания США-1994) в род Haemophilus входит 11 видов; Kilian, Biberstein (1984) авторитетно настаивают на 16 видах. Микроорганизмы рода - неподвижные, грамотрицательные коккобациллярные или палочковидные бактерии, характеризующиеся полиморфизмом; иногда могут образовывать нити. Облигатные паразиты; для роста необходимы ростовые факторы, содержащиеся в эритроцитах (что отражает название Haemophilus), особенно Х (протопорфирин IХ) и/или V (никотинамидадениндинуклеотид – NAD или NAD-фосфат – NADP). Температурные границы роста 24-43°С, оптимальная температура 35-37°С. Некоторые виды Haemophilus входят в состав нормальной микрофлоры организма человека и животных, другие вызывают тяжелые инфекции (менингит, эпиглоттит, пневмонию, перикардит и др.). Типовой вид — Haemophilus influenzaе. Внутри рода микроорганизмы дифференцируют по потребности в указанных факторах роста и биохимическим свойствам (табл. 20).
^ Таблица 20. Биохимические свойства различных видов Haemolphilus
| Вид | Гемо-лиз* | Ката-лаза | Окси-даза | Порфириновый тест | Потребность в факторах | Образование кислоты из: | ||||
| Глюкозы | Фруктозы | Сахарозы | Лактозы | Маннозы | ||||||
| H.influenzae | – | + | + | – | X,V | + | – | – | – | – |
| H.parainfluenzae | – | ± | + | + | V | + | + | + | – | + |
| H.haemolyticus | + | + | + | – | X,V | + | ± | – | – | – |
| H.parahaemolyticus | + | ± | + | + | V | + | + | + | – | – |
| H.aprophilus | – | – | – | ± | – | + | + | + | + | + |
| H.paraprophilus | – | – | + | + | V | + | + | + | + | + |
| H.segnis | – | ± | – | + | V | ± | ± | ± | – | – |
| H.ducreyi | – | + | + | – | X | – | – | – | – | – |
*На КА с эритроцитами лошади
Фактор роста Х содержится в эритроцитах в виде термостабильной группы тетрапирролов, входящих в состав гематина и гемина (принимают участие в цитохромном транспорте электронов и синтезе каталазы и пероксидазы). Виды, нуждающиеся в Х-факторе, не способны синтезировать протопорфирин из d-аминолевулиновой кислоты, что используют для их идентификации (см. ниже), фактор роста V — термолабильный кофермент, включающий НАД (коэнзим I) или НАДФ (коэнзим II). Этот фактор — составная часть витаминов группы В, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях бактериальных клеток. V-фактор присутствует в некоторых продуктах (например, в дрожжах), а также синтезируется некоторыми бактериями (например, сарцинами, стафилококками, нейссериями и др.). Добавление в питательную среду НАД, НАДФ или никотинамидрибозида удовлетворяет потребность микроорганизма в V-факторе. Также рост гемофилов стимулирует посев вблизи колоний микроорганизмов, продуцирующих V-фактор. Потребность в его присутствии испытывает незначительное число видов, а Н. aprophilus не нуждается в обоих факторах.
^
Haemophilus influenzae (палочка Афанасьева-Пфейффера)
Основной патоген; вызывает респираторные и менингеальные инфекции, эндокардиты, абсцессы, артриты, поражения кожи, ногтей и глаз. Гемофильные бактерии первым выделил Кох в начале 80-х гг. XIX в. из конъюнктивального экссудата больного египетским конъюнктивитом. Позднее схожий микроорганизм выделили М.И. Афанасьев (1891) и Пфейффер (1892) из гнойного отделяемого и ткани легкого больного, умершего во время пандемии гриппа. Длительное время его считали возбудителем гриппа (influenza), что объясняет происхождение видового названия. Недавно методом ДНК-гибридизации была установлена идентичность возбудителей конъюнктивита и легочных поражений, а возбудитель конъюнктивита, ранее известный как Haemophilus aegyptius, систематизирован как Haemophilus influenzae биовар aegyptius.
Морфология
Haemophilus influenzae — небольшие (0,3-0,4´1-1,5 мкм) коккобациллы, склонные к плеоморфизму. Часть штаммов имеет полисахаридную капсулу. Клеточная стенка наружной мембраны содержит ЛПС (эндотоксин) и протеины; некоторые из них штаммоспецифичны и идентифицируются серологически, что иногда используют при эпидемиологических обследованиях. В зависимости от состояния популяции, на ША капсулосодержащие штаммы Haemophilus influenzae формируют слизистые М-колонии (сочные, сероватые, иризирующие [дающие радужную окраску] в проходящем свете), образованные мелкими палочками, либо блестящие S-колонии диаметром 3-4 мм (полупрозрачные, при окраске по Грaму капсулы выражены слабо или не выявляются). Некапсулированные штаммы на твердых средах формируют более мелкие зернистые R-колонии (с неровным краем, не иризируют, серовато-белого цвета). Образованы полиморфными палочками и нитевидными формами.
^
Культуральные свойства
Haemophilus influenzae — факультативный анаэроб, хорошо растущий на воздухе. Обязательное условие роста, характерное всех видов Haemophilus -присутствие в питательной среде свежей крови. Перед внесением в среду эритроциты разрушают (наиболее часто инкубируют при 80°С в течение 15 минут, что способствует высвобождению факторов и разрушению ферментов, инактивирующих V-фактор); самостоятельно лизировать эритроциты Haemophilus influenzae не способна. Оптимальные среды для роста – ША, агар Левинталя и среда с переваром Файлдса (пептический перевар эритроцитов). Кроме указанных факторов, для анаэробного роста микроорганизмы утилизируют и другие продукты, содержащиеся в эритроцитах, например, протопорфирин IX, пиридиннуклеотиды и др.
Антигенная структура
Антигенная структура гемофильной палочки включает Аг двух типов — капсульные (5-30% всех штаммов) и соматические. Питтмэн (1931) предложил разделить все известные штаммы по структуре капсульных Аг на 6 серотипов (a-f); каждый из Аг представлен комплексом углеводов. Серодиагностику проводят в РА типоспецифическими политиповыми или монотиповыми сыворотками; возможна трансформация серотипов между штаммами.
Защитные AT к Аг капсулы усиливают поглощение бактерий фагоцитами и стимулируют бактериолиз в присутствии комплемента in vitro. Основную эпидемическую опасность представляет Haemophilus influenzae типа b; ее капсульный Аг состоит из полирибозы и полирибитолфосфата.
Некапсулированные штаммы неоднородны по антигенному набору; один из них — Аг М имеет белковую природу и существует у всех штаммов.
Таблица 2. Инфекционные болезни, вызываемые H.influenzae
|
Клинический материал
Для подтверждения этиологии заболевания и определения чувствительности выделенного возбудителя к антимикробным препаратам обязательным является микробиологическое исследование.
В связи с тем, что гемофильная палочка вызывает широкий спектр инфекций, для микробиологического исследования может направляться различный клинический материал. Наибольшую диагностическую ценность представляют исследования стерильных в норме биологических жидкостей: крови, плевральной, перикардиальной, синовиальной и спинномозговой жидкости (СМЖ).
Основным условием для доказательства этиологической роли H.influenzae в развитии инфекции НДП является предупреждение контаминации клинического материала микрофлорой ВДП. Для этого желательно использовать методики, позволяющие избегать контакта с микрофлорой ВДП (бронхоальвеолярный лаваж, бронхоскопия с "защищенными" щетками).
Забор материала у пациентов с эпиглоттитом (мазок с надгортанника) имеет ограниченную диагностическую значимость и может представлять большую угрозу для жизни пациента (риск развития ларингоспазма). Поэтому это исследование должно проводиться только при наличии условий для оказания экстренной помощи по сохранению проходимости дыхательных путей.
Нецелесообразно микробиологическое исследование назофарингеальных мазков. Даже положительные культуры имеют сомнительную диагностическую ценность в связи с высокой частотой носительства гемофильной палочки здоровыми детьми и взрослыми.
В связи с тем, что гемофильная палочка отличается низкой жизнеспособностью во внешней среде, рекомендуется использовать транспортные среды и немедленно (не позднее 2 ч) доставлять материал в клиническую лабораторию.
Выделение Haemophilus influenzae из клинического материала
Окраска клинического материала по Граму и метиленовым синим. Предварительный диагноз инфекции, вызванной H.influenzae, может быть сделан на основе исследования мазка клинического материала, окрашенного по Граму и/или метиленовым синим.
При окраске по Граму бактерии рода Haemophilus выглядят как мелкие, бледно окрашенные грам(–) палочки, иногда формирующие тонкие филаменты. Небольшие размеры, клеточный полиморфизм и недостаточное прокрашивание сафранином могут существенно затруднять обнаружение гемофильной палочки. Поэтому некоторые авторы предлагают наряду с окраской по Граму проводить окраску метиленовым синим. В этом случае микроорганизмы имеют синий цвет на серо-голубом фоне.
Отрицательные результаты микроскопии не исключают возможности гемофильной инфекции, так как в клиническом материале может присутствовать недостаточное количество микроорганизмов (разрешающая способность световой микроскопии составляет 104–105 бактериальных клеток в 1 мл). Поэтому обязательно культуральное бактериологическое исследование.
Обнаружение капсульного антигена Hib. Для быстрой диагностики инфекций, вызванных H.influenzae типа b, разработаны иммунологические методики обнаружения капсульного антигена в СМЖ, крови, плевральной жидкости и моче: латекс-агглютинация (ЛА), коагглютинация со стафилококковым протеином А (КОА), встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) и иммуноферментный анализ (ИФА) [1, 8].
Наибольшее распространение получили ЛА и КОА с образцами СМЖ. Антитела (IgG) против капсульного антигена Hib наносят на частицы латекса (ЛА) или на стафилококковые клетки (КОА) в качестве "носителя". При взаимодействии антигена, содержащегося в клиническом материале, со специфическими антителами менее чем через 10 мин образуются видимые хлопья.
Коммерческие ЛА наборы, доступные в нашей стране, включают: Slidex Meningite H.influenzae b и Slidex meningite-Kit 5 (bioMerieux), Directigen H.influenzae type b Test Kit и Directigen Meningitis Сombo Test Kit (BBL) и Pastorex (Meningitis (Sanofi Diagnostics Pasteur).
Тесты проводятся в соответствии с рекомендациями изготовителей с обязательным использованием положительных и отрицательных контролей. Необходимо помнить, что тесты могут быть ложноположительными, если ребенок был недавно привит Hib вакциной (в течение 21 дня после иммунизации). Кроме того, могут наблюдаться неспецифические ложноположительные результаты при некоторых заболеваниях, не связанных с гемофильной палочкой.
Разрабатываются другие экспресс-тесты для обнаружения H.influenzae (как типа b, так и нетипируемых) в клиническом материале (с помощью моноклональных антител, конъюгированных с иммунопероксидазой, радиоактивно меченые ДНК-пробы и др.).
Однако ни одно из перечисленных исследований не может заменить культуральное исследование, которое остается "золотым стандартом" микробиологической диагностики.
Исследование спинномозговой жидкости. При поступлении образца СМЖ необходимо безотлагательно начать исследование или хранить материал в термостате при температуре 35–37оС или в крайнем случае при комнатной температуре не более 30 мин. Образцы СМЖ не должны помещаться в холодильник!
Длительное хранение образцов может привести к гибели бактерий и ложноотрицательным результатам (за исключением теста на определение антигенов!).
Для увеличения концентрации микроорганизмов рекомендуется центрифугировать СМЖ (не менее 1 мл образца клинического материала 5–15 мин при 1500–3000 об/мин). Надосадочную жидкость следует асептически перенести в стерильную пробирку, после чего тщательно перемешать полученный осадок с помощью многократного пипетирования.
Исследование СМЖ включает следующие диагностические тесты:
1) окраску отцентрифугированного осадка по Граму и/или метиленовым синим. Для этого на поверхность стерильного предметного стекла наносится капля осадка, после высыхания которой добавляется вторая капля, что позволяет увеличить количество бактериальных клеток в мазке. Не следует распределять осадок по большой поверхности, так как это уменьшает вероятность обнаружения микроорганизмов, находящихся в материале в небольшом количестве;
2) определение антигена Hib в надосадочной жидкости. Некоторые авторы считают, что определение антигенов является более чувствительным тестом, чем культуральное исследование у пациентов, получавших антибиотики до забора СМЖ;
3) бактериологическое исследование осадка. Проводится посев нескольких капель осадка СМЖ на поверхность чашек с шоколадным и кровяным агаром, а также в двухфазную или жидкую среду. Чашки инкубируют при температуре 35–37оС в атмосфере с 5–10% СО2.
Другие биологические жидкости (синовиальная, перикардиальная, плевральная) должны окрашиваться по Граму и исследоваться культурально.
Исследование крови. Образцы крови, помещенные во флаконы с двухфазной или жидкой средой, инкубируют в течение 18–24 ч при температуре 35–37оС. Из-за слабого роста гемофильной палочки в жидкой среде может отсутствовать выраженное помутнение среды. Поэтому рекомендуется проводить "слепое" субкультивирование или приготовление и окрашивание мазка через 6–12 ч после начала инкубации из флакона без видимого роста. Предпочтение отдается субкультивированию, так как разрешающая способность световой микроскопии (104–105 КОЕ/мл) незначительно превосходит плотность, при которой становится видимым рост во флаконе (106–107 КОЕ/мл).
Для субкультивирования асептически забирается несколько капель предварительно тщательно перемешанной среды и распределяется по поверхности шоколадного агара. Чашки инкубируются при температуре 35–37оС и 5–10% СО2 в течение 24–48 ч.
После промежуточного субкультивирования следует продолжить инкубирование флаконов. Через 24 ч инкубации независимо от отсутствия или наличия мутности во флаконе следует приготовить мазок.
Результаты микроскопии следует немедленно сообщать лечащему врачу. Если имеется видимое помутнение среды даже при отрицательном мазке или положительный мазок при отсутствии мутности, то следует субкультивировать материал на шоколадном агаре и КА.
Исследование материалов, содержащих микробные ассоциации (мокрота, материал из среднего уха и пазух носа и т.д.). Перед посевом полученного клинического материала рекомендуется проводить микроскопическое исследование окрашенных мазков. Это позволяет получить предварительные данные о возможных возбудителях, а также оценить качество материала (мокроты).
Оценка качества мокроты позволяет повысить эффективность микробиологического исследования и снизить расходы лаборатории. Критерием пригодности мокроты для бактериологического исследования является наличие более 25 сегментоядерных лейкоцитов и не более 10 эпителиальных клеток в поле зрения при просмотре не менее 20 полей зрения мазка, окрашенного по Граму (при увеличении x 100).
Для улучшения выделения гемофильной палочки рекомендуется использовать среды, содержащие бацитрацин (300 мкг/мл) или диски с бацитрацином (10 ЕД), или сапонинобацитрациновые диски.
Таблица 3. Дифференциально-диагностические свойства рода Haemophilus
|
Таблица 4. Биотипирование H.influenzae
|