Анабиоз и основные закономерности анабиоза.
Различные подходы сохранения клеточных культур.
Под анабиозом понимают способность биологических объектов обратимо приостанавливать или предельно затормозить процессы их жизнедеятельности. Выделяют следующие основные признаки анабиотического состояния:
ü отсутствие или предельное затормаживание метаболизма;
ü сохранение структуры в течение продолжительного времени;
ü отсутствие в жидкой фазе заметных количеств свободной воды как непрерывной среды;
ü повышенная устойчивость к экстремальным факторам;
ü способность восстанавливать процессы жизнедеятельности.
Существует разные подходы к сохранению культур: криосохранение, замедление роста, сушка (распылительная и лиофильная) – широко применяемое в микробиологии для клеток микроорганизмов, в настоящее время неприемлемо для культур тканей высших растений.
Наука криобиология и криосохравнение. Факторы, влияющие на успех низкотемпературной консервации. Методы криосохранения.
Криосохранение (от греческого криос – мороз) - хранение в замороженном состоянии. Однако на практике обычно это хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (-79оС), в морозильниках с ультранизкой температурой (-80оС и ниже), в парах (приблизительно -140оС) или непосредственно в жидком азоте (-196оС). Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC. Низкотемпературная консервация зависит от: вида и типа клеток; их концентрации в суспензии; состава среды для консервирования; вида и концентрации криопротектора; режима охлаждения и отогрева, а также способа реабилитации клеток после отогрева.
Реакция клеток на низкую температуру. Холодовый шок.
Устойчивость к холоду и морозостойкость. Факторы, влияющие на процесс замерзания.
Термин «холодовой шок» (повреждение от охлаждения) используют для описания чувствительности ткани к понижению температуры. Холодовый шок часто связан со скоростью охлаждения: быстрое охлаждение обычно вызывает более значительные повреждения, чем медленное. К основным факторам, влияющим на процесс замерзания, относятся; переохлаждение, образование кристаллов льда, концентрирование растворенных в воде веществ, сжатие клеток, внутриклеточный лед. Повреждения можно уменьшить или преодолеть введением в среду криопротекторов, специфических фосфолипидов или различных других соединений или изменение концентрации специфических анионов.
Факторы, влияющие на выживаемость клеток, хранящихся при низких температурах. Двухступенчатое охлаждение. Витрификация. Криопротекторы.
К факторам, влияющим на выживаемость клеток, хранящихся при низких температурах относятся: скорости охлаждения, криопротекторы, витрификация, оттаивание, обработка после оттаивания.
Двухступенчатое охлаждение - метод предварительного замораживания клеток быстрым охлаждением до температуры ниже нуля при кратковременном выдерживании их при этой температуре перед быстрым охлаждением до температуры хранения. При достаточно быстром охлаждении водного раствора время, необходимое для роста кристаллов льда, ограничено, и раствор остается аморфным. Ниже определенной температуры (т.е. точки перехода в стекловидное состояние) это условие становится стабильным, и раствор витрифицируется. Криопротекторы - гетерогенная группа соединений, которые ослабляют эффект кристаллизации, изменяя её характер, препятствуют слипанию и денатурации макромолекул, способствуют сохранению целостности мембран клеток. Криопротекторы условно разделяют на две группы: проникающие и непроникающие соединения.
Оттаивание. Обработка после оттаивания. Оценка жизнеспособности
клеток после криосохранения.
Повреждение при оттаивании происходит главным образом в результате «блуждающей» рекристаллизации, т.е. роста маленьких кристаллов льда, образуемых при охлаждении. Быстро охлажденные клетки чаще содержат внутриклеточный лед, и, следовательно, быстрое оттаивание должно обеспечить лучшее выживание, чем медленное. Было получено прямое доказательство роста внутриклеточного льда при медленном оттаивании. Существует и другой возможный механизм повреждения при оттаивании. Как предполагают, существует разница в химическом потенциале внутри и снаружи клетки, обусловленная различием размеров кристаллов льда в этих двух пространствах, что приводит к образованию движущей силы для перемещения воды через клеточную мембрану. Такое движение воды и (или) возникающее в результате этого увеличение содержания осмотиков внутри клетки, очевидно, и вызывает повреждения клеток. Для клеток после оттаивания нужен особый уход. Добавление в среду определенных веществ, например сыворотки или непроникающих веществ, часто может значительно уменьшить стресс разведения, препятствуя быстрому осмотическому притоку воды, в то время как криопротектор диффундирует наружу. Однако во многих случаях полное удаление криопротектора нежелательно, и продолжительное промывание может еще больше травмировать клетки.
Для определения выживаемости клеток, тканей, органов или организмов после низкотемпературного хранения существует много специфических методов. Определенным тестом на выживание, его количественной оценкой, является рост после восстановления, хотя для быстрой оценки пригоднее тест на жизнеспособность. Качественные оценки требуют соответствующих анализов. Существуют три теста на жизнеспособность. Первые два используются для образцов, видимых под микроскопом в проходящем свете, т.е. клеточных суспензий, протопластов, небольших каллусных и организованных структур. Третьий, ТТХ-тест, удобен для клеток, каллусов и плотных, относительно крупных организованных структур, однако он недостаточно эффективен на зеленом материале.
Основные достижения в хранении культур тканей растений.
Сохранение in vitro генофонда.
Живая ткань в любой форме представляет собой незаменимый генетический материал, который требует хранения и последующего использования. Методические достижения в области криобиологии позволяют успешно сохранять живые ткани длительное время (протопласты, пыльца, суспензионные культуры клеток, культуры каллусов, зародышей, культуры верхушек побегов), а затем использовать их в различных биотехнологических целях. Разработка методов культивирования клеток и тканей в условиях in vitro позволила использовать их для сохранения генофонда различных растительных объектов. Дополнительное достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro - возможность разместить на 1м2 площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.
Метод криоконсервации клеток животных и человека. Крионика.
Хранить можно не только клетки растений, но и клетки животных. Используя метод криоконсервации генетического материала, можно организовывать обмен генами между популяциями, в которых генетическое разнообразие пропадает из-за их низкой численности, позволяет обеспечить поддержание генетической структуры вида, предотвращает вырождение малых популяций, что особенно актуально для редких видов животных. Как форма биологического страхования может рассматриваться выделение, а также сохранение СК человека, ведь именно клеточным технологиям на основе СК, по мнению ученых, принадлежит будущее медицины. С криосохранением клеток человека тесно связана крионика - метод сохранения человека до того момента в будущем, пока не будут открыты действенные методы борьбы с тяжелыми заболеваниями, в основном онкологическими. Исследования в крионике представляют несомненный научный интерес, но о реальной возможности ее применения можно будет говорить только тогда, когда будет, успешно разморожен, хотя бы один из криоционированных пациентов.
Используемая литература.
1. Биотехнология лекарственных средств. Учебное пособие для вузов./под. ред. Быкова В.А., Далина М.В.-М.: Изд-во ММА им. И.М.Сеченова-1991, с.1-30.
2. Биотехнология. Учебное пособие для вузов./под ред. Катлинского, М., Изд-во «Академии», 2007. с. 204-218.
3. Т.П. Прищеп, В.С. Чучалин, К.Л. Зайков. и др. «Основы фармацевтической биотехнологии». Учебное пособие. Изд-во Сиб. Гос. Мед. Университета. 2006, с. 187-199.
4. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М.: Академия – 2003 -451с.
5. М.Е. Беккер, Г.К. Лиепиньш, Е.П. Райпулис. Биотехнология. М., ВО «Агропромиздат», 1990, 334с.
6. В.А. Сидоров. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев. «Наукова Думка», 1990, 280с.
7. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. / под ред. Р.Г. Бутенко. М., 1991, 273с.
8. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М., Пичугина Е.М., Фрейдин М.И., Чериков В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 251 – 260.
9. Caplan AI, Bruder SP. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 2001, v. 7, N 6, p. 259-264.
10. Caplan AI, Dennis JE. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 2006, v. 98, N 5, p. 1076-1084.
11. Онтогенез, 2003. Т. 34. № 3. Выпуск целиком посвящен проблеме стволовых клеток.
12. Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. М., РеМетекс. 2002. 160с
13. Treiman N., Kork ko J., Iberson D. Stem Cells, 2001, v.19, N 3. P. 408-418.
14. Корочкин Л.И. Клонирование животных. Соровский образовательный журнал, 1999, N 4, с. 10-16.
15. Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж.Б. и др. Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989. Т. 1, 2
16. журнал Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.
17. журнал Клеточные технологии в биологии и медицине.
18. А.Б. Смоленинов, Е.В. Жаров, К.Л. Козлов, Д.А. Кириллов «Основы клеточной и генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний, Москва, 2005.
19. Шевченко Ю.Л. «Медико-биологические и физиологические основы клеточных технологий в сердечно-сосудистой хирургии», Москва, «Наука», 2006, 288с.
20. Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, Т.И. Тихоненко, М.И. Прокопьев. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., Изд-во ВО «Агропромиздат», 1990, с.187-191.
21. Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63 – 69.
22. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений. Культура клеток растений. М., Наук, 1981, с. 37-50.
23. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования in vitro. Физиология растений, 1999, т. 46, n 6, с. 919-929.