В современных биотехнологических процессах, основанных на использовании микроорганизмов, продуцентами белка служат дрожжи, бактерии, одноклеточные водоросли и микроскопические грибы.
1.1. Кормовые дрожжи
Кормовые дрожжи впервые стали использовать как источник белка для человека и животных в Германии во время первой мировой войны, когда была разработана промышленная технология культивирования пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), предназначенных для добавления в продукты питания. В нашей стране дрожжи выращивали на гидролизатах из отходов древесины и другого целлюлозосодержащего растительного сырья, которые при гидролизе образуют легкоусвояемые для микроорганизмов формы углеводов. В настоящее время нашей биотехнологической промышленностью на основе гидролиза растительного сырья производится значительный объем кормовых дрожжей для сельского хозяйства.
В качестве исходного сырья при такой технологии получения кормового белка обычно используются отходы целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности, солома, хлопковая шелуха, корзинки подсолнечника, льняная костра, стержни кукурузных початков, свекловичная меласса, картофельная мезга, виноградные выжимки, пивная дробина, верховой малоразложившийся торф, барда спиртовых производств, отходы кондитерской и молочной промышленности.
Измельченное растительное сырье, содержащее большое количество клетчатки, гемицеллюлоз, пентозанов, подвергается кислотному гидролизу при повышенном давлении и температуре, в результате чего 60-65 % содержащихся в них полисахаридов гидролизуются до моносахаридов. Полученный гидролизат отделяют от лигнина, избыток кислоты, применяемый для гидролиза, нейтрализуют известковым молоком или аммиачной водой. После охлаждения и отстаивания в гидролизат добавляют минеральные соли, витамины и другие вещества, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов. Полученная таким образом питательная среда подается в ферментный цех, где осуществляется выращивание дрожжей.
Для культивирования на гидролизатах растительных отходов наиболее эффективны дрожжи родов Candida, Torulopsis, Saccharomyces, которые способны использовать в качестве источника углерода гексозы, пентозы и органические кислоты. При оптимальных условиях из 1т отходов хвойной древесины можно получить 200кг кормовых дрожжей [1].
Для получения кормовых дрожжей применяется технология их глубинного выращивания в специальных аппаратах – ферментерах, в которых обеспечивается режим постоянного перемешивания суспензии микробных клеток в жидкой питательной среде и оптимальные условия аэрации. В целях поддержания заданного температурного режима в конструкции ферментера предусматривается система отвода избыточного тепла. Рабочий цикл выращивания культуры дрожжей длится около 20 ч. По окончании рабочего цикла культуральная жидкость вместе с суспендированными в ней клетками дрожжей выводится из ферментера, а в него вновь подается питательный субстрат и культура дрожжевых клеток для выращивания.
Выведенная из ферментера суспензия микробных клеток далее подается на флотационную установку, с помощью которой производится отделение биомассы дрожжей от культуральной жидкости. В процессе флотации происходит вспенивание суспензии, при этом микробные клетки всплывают на поверхность вместе с пеной, которая отделяется от жидкой фазы декантацией. После отстаивания дрожжевая масса концентрируется с помощью сепаратора. Для достижения лучшей перевариваемости дрожжей в организме животных проводится специальная обработка микробных клеток (механическая, ультразвуковая, термическая, ферментативная), обеспечивающая разрушение их клеточных оболочек. Затем дрожжевая масса упаривается до необходимой концентрации и высушивается, влажность готового продукта не должна превышать 8-10 %.
В сухой дрожжевой массе содержится 40-60 % сырого белка, 25-30 % усвояемых углеводов, 3-5 % сырого жира, 6-7 % клетчатки и зольных веществ, большое количество витаминов (до 50 мг%).
При выращивании микроорганизмов на n-парафинах нефти в приготовленную из них питательную среду добавляют макро- и микроэлементы, необходимые витамины и аминокислоты, а в качестве источника азота аммиачную воду. В процессе культивирования дрожжей в ферментере поддерживается оптимальный температурный режим и режим аэрации. Наиболее эффективны для выращивания на n-парафинах нефти отселектированные штаммы дрожжей Candida guilliermondii. Выделение и сушка дрожжевой массы проводится примерно по такой же технологии, как и в гидролизном производстве. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК) для кормления сельскохозяйственных животных, содержащий до 50-60 % белковых веществ.
Хороший субстрат для выращивания кормовых дрожжей - молочная сыворотка. Для выделения из молочной сыворотки белков разработана эффективная технология с применением метода ультрафильтрации низкомолекулярных веществ через мембраны. Получаемые таким способом белки используются для приготовления сухого обезжиренного молока или в качестве пищевой белковой добавки. Остающиеся после отделения белков жидкие отходы (пермеат), содержащие лактозу, могут быть затем переработаны путем культивирования дрожжей в обогащенные белками кормовые продукты [3].
Дрожжевая масса, полученная после культивирования дрожжей на низших спиртах (метаноле и этаноле), отличается высоким содержанием белков (56-62 % от сухой массы) и в ней меньше содержится вредных примесей, чем в кормовых дрожжах, выращенных на н-парафинах нефти.
Как показывают опыты по изучению питательных свойств кормовых дрожжей, они достаточно хорошо перевариваются в организме животных (перевариваемость белков 80-90 %), по сумме незаменимых аминокислот близки к эталону ФАО, а по содержанию в белках лизина, треонина, валина и лейцина существенно превышают эталон ФАО. Вместе с тем белки дрожжей частично не сбалансированы по метионину и в них мало содержится других серосодержащих аминокислот.
По сравнению с растительными источниками белков кормовые дрожжи имеют повышенное содержание нуклеиновых кислот (4-6 % от сухой массы), которые в такой концентрации оказывают вредное воздействие на организм.
Кормовые дрожжи, культивируемые на питательной среде из n-парафинах нефти, могут содержать многие вредные примеси – производные бензола, D-аминокислоты, аномальные липиды, различные токсины и канцерогенные вещества, поэтому их подвергают специальной очистке.
В настоящее время ведется работа по совершенствованию производственной технологии. Кроме того, важное значение имеет создание высокопродуктивных штаммов дрожжей, способных накапливать много белка, быстро наращивать биомассу и эффективно использовать субстрат для своей жизнедеятельности.
Наряду с использованием дрожжевых белков в качестве кормовой добавки при балансировании рационов сельскохозяйственных животных ставится задача сделать эти белки пригодными для питания человека.
При переработке в пищевой белок биомассу дрожжей тщательно очищают. С этой целью клеточные оболочки дрожжевых клеток разрушают с помощью механической, щелочной, кислотной или ферментативной обработки и затем экстрагируют гомогенную дрожжевую массу органическим растворителем. После очистки от органических и минеральных примесей полученный дрожжевой продукт обрабатывают щелочным раствором для растворения белков, затем белковый раствор отделяют от оставшейся массы дрожжей и направляют на диализ. В процессе диализа из белкового раствора удаляются низкомолекулярные примеси. Очищенные диализом белки осаждают, высушивают и полученную белковую массу используют в качестве добавок в различные пищевые продукты: сосиски, студни, паштеты, мясные и кондитерские начинки [3].
Белки дрожжей находят также применение при получении искусственного мяса, гидролизаты белков используют в качестве вкусовых приправ, для приготовления медицинских препаратов и лечебного питания.
1.2. Бактерии
Наряду с получением кормовых дрожжей важное значение для кормопроизводства имеют также бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка 60-80 % от сухой массы. Известно более 30 видов бактерий, которые могут быть использованы в качестве источников полноценного кормового белка. Бактерии способны наращивать биомассу в несколько раз быстрее дрожжевых клеток и в белке бактерий содержится значительно больше серосодержащих аминокислот, вследствие чего он имеет более высокую биологическую ценность по сравнению с белком дрожжей. Источником углерода для бактерий могут служить различные газообразные продукты, низшие спирты, водород.
При использовании в качестве сырья газообразных продуктов, основным компонентом которых является метан, питательную смесь под давлением подают в специальный ферментер струйного типа.
Чаще всего на газовых питательных средах выращивают бактерии рода Methylococcus,способные при оптимальных условиях утилизировать до 80-90 % подаваемого в ферментер метана [4].
По окончании ферментации клетки бактерий осаждают и отделяют от питательной среды на сепараторе. Полученную бактериальную массу затем подвергают механической или ультразвуковой обработке с целью разрушения клеточных оболочек, после чего высушивают и используют для приготовления кормовых белковых концентратов.
Высокой интенсивностью синтеза белков характеризуются водород окисляющие бактерии, способные накапливать в своих клетках до 80 % сырого белка в расчете на сухое вещество. Эти бактерии используют энергию окисления водорода для утилизации углекислоты, а некоторые штаммы и для усвоения атмосферного азота. Для культивирования водород окисляющих бактерий в составе газовой среды обычно содержится 70-80 % водорода, 20-30 % кислорода и 3-5 % углекислоты. Высокую эффективность при выращивании на такой газовой среде имеют бактерии родов Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobaster, Corinecteriu.
Обычно кормовой белок бактериального происхождения добавляют в комбикорма в количестве 2,5-7,5 % от белка рациона. Основное препятствие, которое не позволяет его использовать в большей концентрации,-повышенное содержание нуклеиновых кислот (10-25 %). Кроме того, в бактериальной массе наряду с полезными компонентами в значительном количестве синтезируются трудно усвояемые формы липидов; сложнее и дороже методы выделения и очистки бактериальных белковых препаратов.
Отдельно можно выделить силикатные бактерии. Уже давно предполагали, что микроорганизмы участвуют в процессах разложения горных пород и алюмосиликатов в почве. Первые указания на это явление имеются в трудах Ч. Дарвина. В этом же был убежден и В. И. Вернадский. И действительно, в середине нашего века удалось показать, что поверхностный слой горных пород разрушается в результате деятельности микроорганизмов, в первую очередь бацилл, так как они имеют, в сравнении со всеми другими одноклеточными, самую мощную ферментативную систему. Е. Виноградов детально изучил биологию так называемых силикатных бактерий, их химический состав и состав основания ДНК и выяснил их полное тождество с описанными ранее И. Красильниковым Bacillus mucilaginosus. Bacillus mucilaginosus широко распространены в природе. Это обусловлено тем, что они синтезируют свою биомассу, усваивая углерод и азот из атмосферы, а фосфор и кремний - из соответствующих минералов, т. е. из источников питания, недоступных для других микроорганизмов. Силикатные бактерии являются слабыми фиксаторами азота из атмосферы и поэтому могут существовать в безазотистых средах. Они способны частично высвобождать калий и фосфор из минералов, содержащих эти элементы в не усвояемой растениями форме, что позволяет использовать бациллы как бактериальные удобрения. Их рекомендуется использовать в композиции с фосфоритной или апатитовой мукой. В последние годы микробиологическая наука изыскивает новые резервы увеличения кормового белка. И все большее внимание привлекают микроорганизмы Bacillus mucilaginosus, представляющие собой мощный потенциальный источник белка. Использование их белково-ферментной биомассы в кормлении сельскохозяйственных животных и домашней птицы впервые с успехом осуществлено в нашей стране.[5]
Применение биомассы Bacillus mucilaginosus в животноводстве позволяет не только значительно увеличить резерв кормового белка и продуктивность животных, но и существенно сэкономить расход зерна, молока и других дефицитных кормов животного и растительного происхождения. Биомасса содержит также мощную ферментативную систему, способную расщеплять клетчатку, переводя ее в усвояемые организмом животного углеводы. Этот процесс происходит как в организме животного, так и в период силосования и сенажирования кормов.
1.3. Одноклеточные водоросли
В России и ряде других стран для производства кормового белка используются одноклеточные водоросли Chlorella и Scenedesmus, а также сине-зеленые водоросли из рода Spirulina, которые способны синтезировать белки и другие органические вещества из углекислоты, воды и минеральных веществ за счет усвоения энергии солнечного света. Для их выращивания необходимо обеспечивать определенный режим освещения и температуры, а также требуются большие объемы воды.
По интенсивности накопления биомассы водоросли, хотя и уступают кормовым дрожжам и бактериям, значительно превосходят сельскохозяйственные растения. При их выращивании в культиваторах открытого типа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой биомассы в год, тогда как при возделывании пшеницы – 3-4 т, риса – 5т, сои – 6 т, кукурузы – 7т.
Содержание белков в клетках хлореллы и сценедемус составляет 45-55 % в расчете на сухую массу, а в клетках спирулины достигает 60-65 %. Белки водорослей хорошо сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот, недостаточно содержится лишь метионина. Наряду с высоким содержанием белковых веществ в клетках водорослей довольно много синтезируется полиненасыщенных жирных кислот и провитамина А – каротина. Каротина в биомассе водорослей в 7-9 раз больше, чем в травяной муке из люцерны, отличающейся наиболее высоким содержанием этого провитамина среди кормовых трав. Содержание нуклеиновых кислот в одноклеточных водорослях значительно ниже (4-6 %), чем у бактерий, однако несколько выше по сравнению с растительными источниками белка (1-2 %) [1].
Технология получения белковой массы из клеток водорослей включает выращивание промышленной культуры в культиваторах открытого или закрытого типа, отделение водорослей от массы воды, приготовление товарного продукта в виде суспензии, сухого порошка или пастообразной массы. Процесс отделения клеток водорослей от массы воды энергоемкий, так как необходимо перерабатывать большие объемы жидкости.
Вначале отстаивают клеточную суспензию, затем клетки водорослей отделяют от воды декантацией. Для ускорения осаждения клеток часто применяется метод химический флоккуляции, вызывающий быструю коагуляцию частиц. После осаждения клеточной биомассы ее пропускают через сепаратор, в результате чего происходит концентрирование суспензии до необходимой концентрации. Если требуется получить пастообразный препарат, то полученную белковую массу высушивают. Для улучшения переваримости биомассы клеток хлореллы и сценедемус проводится их обработка с целью разрушения клеточных оболочек.
В нашей стране наиболее распространено выращивание хлореллы, которая применяется для кормления сельскохозяйственных животных в виде суспензии или сухого порошка. Суточная норма суспензии хлореллы при кормлении молодняка крупного рогатого скота 3-6 л, взрослых животных 8-10 л. При добавлении в корм жвачных животных муки хлореллы допускается замена 50 % растительного белка белком водоросли.
Важное значение имеет выращивание водорослей на стоках промышленных предприятий, тепловых электростанций, животноводческих комплексов, так как в этих случаях наряду с получением кормового белка одновременно решаются проблемы, связанные с защитой окружающей среды. Так, например, выращивание культуры сценедемус или хлореллы на стоках животноводческих комплексов в течение 15 сут позволяет почти полностью очистить их от органических веществ, исчезает запах и цвет. При культивировании водорослей на промышленных стоках используется отводимый с этих объектов избыток тепла, а также утилизируется углекислота, образуемая как побочный продукт технологических процессов и в результате сжигания различных отходов.
В связи с тем, что биомасса водорослей рода Spirulina легко переваривается ферментами желудочного сока и характеризуется высоким содержанием белков (до 70 % сухой массы), хорошо сбалансированных по аминокислотному составу, она в ряде стран используется для приготовления продуктов питания, главным образом кондитерских изделий, обогащенных белком [2].
1.4. Микроскопические грибы
Ценным источником хорошо сбалансированных по аминокислотному составу белков являются клетки мицелия многих микроскопических грибов. По своим питательным свойствам белки грибов приближаются к белкам сои и мяса, вследствие чего могут использоваться не только для приготовления кормовых концентратов, но и как добавка в пищу человека. Сырьем для промышленного выращивания микроскопических грибов обычно служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллюлозы, лигнин. При этом одновременно решаются две важные задачи- получение белковой массы и утилизация отходов растениеводства, деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, которые могут быть источниками загрязнения окружающей среды.
Особенно важно найти активные штаммы микроорганизмов, способные утилизировать углерод лигнина, обладающего высокой устойчивостью к разложению микрофлорой. В природе лигнин разлагается лишь грибами коричневой и белой гнили родов Stropharia, Pleurotis, Abortiporus, Coriolus и др. В настоящее время в процессе исследований отобраны атоксичные быстрорастущие штаммы мезо- и термофильных грибов для промышленного культивирования из родов Penicillium, Aspergillus, Fusrium, Trichoderma. Клетки мицелия этих грибов имеют тонкую клеточную оболочку, вследствие чего очень хорошо перевариваются в желудочно-кишечном тракте животных. Они содержат в своем составе комплекс ароматических веществ, улучшающих хи вкусовые качества, богаты витаминами и легкоусвояемыми липидами. По сравнению с дрожжевыми белки микроскопических грибов отличаются повышенным содержанием аминокислот и лучшей усвояемостью. Концентрация нуклеиновых кислот в грибном мицелии (1-4 % от сухой массы) почти такая же, как в тканях растительного организма. Вместе с тем в биомассе грибов значительно меньше, чем в дрожжах, синтезируется белков (20-60 % от сухой массы) и у них относительно медленней происходит рост биомассы (удвоение биомассы через 4-16 ч, тогда как у дрожжей через 2-3 ч) [2].
Низшие мицельные грибы, культивируемые на целлюлозо-лигнинсодержащих растительных отходов, вследствие их способности синтезировать комплекс гидролитических ферментов разлагают целлюлозу и лигнин до простых веществ, из которых образуются аминокислоты и белки. В целях ускорения роста грибов проводится предварительная обработка растительного сырья, повышающая доступность его компонентов для утилизации микроорганизмами. Чаще всего применяют кислотно-щелочной способ обработки целлюлозо- и лигнинсодержащих отходов, отпаривание под давлением, обработка аммиаком и каустической содой. После такой обработки происходит полное или частичное разложение трудногидролизуемых полисахаридов и лигнина, что обеспечивает ускоренный рост грибной массы и сокращение сроков промышленного культивирования грибов (до 7-8 сут).
В зависимости от способа подготовки растительного сырья для культивирования микроскопических грибов применяют и соответствующие технологии их выращивания. Для культивирования грибов на твердой питательной среде разработан метод твердофазной ферментации, который включает измельчение и обработку растительного сырья парами воды и аммиака, обогащение этого сырья минеральными веществами, посев и выращивание мицелия грибов в заданном режиме аэрации и поддержания оптимальной температуры. Однако при такой технологии культивирования грибов коэффициент использования растительного сырья невысокий, что предопределяет и сравнительно невысокий уровень содержания белка в выращиваемой грибной массе (20-30 % от сухой массы).
Более высокий коэффициент использования сырья обычно достигается при выращивании грибов на гидролизатах растительных отходов и жидких отходах деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности, для этих целей применяют метод глубинного культивирования, как и при выращивании кормовых дрожжей. Содержание белков в грибной массе, выращенной на жидкой питательной среде, может достигать 50-60 % от сухой массы.
Хорошая переваримость грибной белковой массы в организме животных, а также низкий уровень содержания нуклеиновых кислот позволяют ее использование в качестве кормовой добавки в значительно большей концентрации, чем кормовые дрожжи. Обычно при кормлении молодняка животных допускается введение в кормовые рационы грибного белка в пределах 15-20 % от белка корма, а при кормлении взрослых животных возможна замена в корме 50 % растительного белка на грибной [3].
Заключение
Микробная клетка способна за сутки переработать огромную массу питательных веществ, в 40 раз превышающую ее собственную. Необычайная скорость размножения, возможность синтезировать в больших количествах самые разнообразные вещества и вызывать биохимические процессы, которые не могут осуществлять клетки животных и высших растений, - все эти свойства микробов превращают их в непревзойденных производителей многих ценных продуктов. И прежде всего белка, который по своему аминокислотному составу, пищевым качествам приближается к естественному продукту, а то и превосходит его.
Способ получения микробного белка - индустриальный, не зависит ни от климата, ни от сезона. Его можно использовать и на Крайнем Севере, и в экваториальных странах. Важно и то, что бактерии, дрожжи, грибы и водоросли, применяемые в биотехнологии, отличаются очень высокой продуктивностью
Список литературы
1. Биотехнология. Производство белковых веществ / В.А. Быков [ и др.]. - М.: Высшая школа, 1987. – 242 с.
2. Воробьева А.И. Промышленная микробиология / А. И Воробьева. – М.: изд. Московского университета, 1989. – 319 с.
3. Сельскохозяйственная биотехнология: учебник / В. С. Шевелуха [и др.]; под ред. В. С Шевелухи – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш. шк., 2003. – 469 с.
4. Промышленная биотехнология: производство белка микроорганизмов [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.biotechnolog.ru/prombt/prombt6_1.htm
5. Воронков М.Г., Кузнецов И.Г., Кремний в живой природе / Академик Седов К.Р. (отв. ред.) - Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1984. -157 с. - Серия "Человек и окружающая среда" - АН СССР. Сиб. отд-ние. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://chemlib.ru/books/item/f00/s00/z0000048/st006.shtml
6. Глик Б., Пастернак Дж., Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. – М.: Мир, 2002 – 586 с. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://www.chem21.info/info/199848/