Достоверно доказать наличие ВИЧ-инфекции и заболевания СПИДом можно только путём выявления в организме больного самого возбудителя. Однако сделать это достаточно сложно. Более распространенный способ диагностики СПИДа основан на обнаружении специфических противовирусных антител с помощью различных иммунологических реакций (иммуноферментный анализ, метод флуоресцирующих антител, реакция агглютинации латекса, имуноблоттинг).
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции базируется на трех направлениях: а) индикация ВИЧ и его компонентов, б) выявление анти-ВИЧ, в) определение изменений в иммунной системе.
Среди существующих методов лабораторной диагностики наиболее распространены серологические - выявление антител к антигенам вируса.
В состав ВИЧ входят структурные гены gag (group-specific-antigens), pol (polymerase) и env (envelope), кодирующие трансляцию белков, из которых строится вирус. Группу регуляторных генов ВИЧ составляют tat, трансактиватор всех вирусных белков, rev, регулирующий экспрессию вирусных белков, vif, являющийся вирусным инфекционным фактором, nef - негативный фактор экспрессии и vpx и vpr, функция которых пока не установлена. Ген gag кодирует белки сердцевины вируса и первичным продуктом трансляции его является р53 - белок-предшественник, расщепляющийся на три (р15, р17 и р 24) или с образованием при расщеплении первоначально промежуточного белка р39, который затем расщепляется на белки р17 и р24. У ВИЧ-инфицированных в большинстве случаев образуются антитела именно к этим антигенам, причем антитела к р24 выявляются на ранней стадии инфекции, ибо р24 более иммуногенен, чем р17. Ген роl кодирует белки р51/66 и р31, представляющие собой реверстранскриптазу и эндонуклеазу вируса.
|
|
Для выявления антител при ВИЧ-инфекции в основном используют иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ). В первом случае выявляются суммарные антитела к белкам ВИЧ, во втором - к отдельным белкам.
В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, на которые сорбируются антитела больного, а комплекс антиген-антитело выявляется с помощью коньюгата антивидового иммуноглобулина с ферментом. Метод довольно специфичен (99%) и достаточно чувствителен (93-99%), позволяет выявлять вирусоспецифические антитела у 95% инфицированных. Отрицательные 5% случаев приходится на ранние этапы инфицирования, когда антител еще мало в сыворотке крови или на терминальные фазы болезни, когда организм уже не в состоянии синтезировать антитела в силу резкого истощения иммунной системы. Кроме того в ходе инфекционного процесса наблюдаются периоды исчезновения антител из крови, что также обусловливает отрицательные результаты ИФА. Наоборот, возможны ложноположительные данные ИФА, в основном у больных с аутоиммунными заболеваниями, при инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр, когда происходит перекрестная реакция антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейн-Барр, или к молекулам главного комплекса гистосовместимости. Встречаются подобные ложноположительные реакции в 0,02-0,5% случаев.
Сравнительно высокий процент ложно-положительных реакций в ИФА в данном случае объясняется качеством тест-систем, но расхождения даже ниже, чем в экономически развитых странах. Сейчас внедряется в практику тест-системы 3-4 поколения, в основе которых лежит использование в качестве антигена: а) лизатов ВИЧ-1, б) рекомбинантных белков ВИЧ-1, в) введение антигенов субтипа “О” ВИЧ-1, г) коньюгаты, позволяющие определять IgM, IgG, IgA. Все это снижает частоту ложноположительных реакций ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции, дает возможность раннего выявления сероконверсии. Улучшение тест-систем, выпускаемых некоторыми фирмами, обусловило более высокую чувствительность, чем иммунный блот, используемый для подтверждения специфичности ИФА. Поэтому ИФА с некоторыми тест-системами может использоваться не только как метод для скрининговых исследований, но и подтверждающих.
|
|
Антитела к основным внутренним белкам (р17, р24) обнаруживаются у 3/4 инфицированных и примерно у половины больных СПИДом.
Иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве экспертного метода. ИБ сочетает в себе определение антител к отдельным белкам вируса с предварительным электропереносом на нитроцеллюлезную полоску (стрип) антигенов. В ИБ чаще всего выявляются антитела против gp41, обнаружение же в ИБ антител против р24 при профилактических обследованиях не дает оснований для окончательного решения вопроса об инфицировании. Используемый в последнее время рекомбинантный белок для ИБ улучшает оценку результатов.
По данным при использовании тест-систем ведущих фирм мира у больных ВИЧ-инфекцией в иммунном блотинге во всех случаях выявляются антитела к gp160 и лишь у трети (38,8%) к р15.
ВОЗ (1991) предлагает следующий принцип оценки результатов иммунного блота: а) положительный результат - обнаружение в сыворотке крови антител к двум вирусным белкам из группы env с наличием или отсутствием белков - продуцентов gag и pol; б) отрицательный результат - отсутствие каких либо антител и в) неопределенный результат - обнаружение в сыворотке крови антител к белкам из группы gag и pol. Чаще всего неопределенный результат связан с белками- продуцентами экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/17, р24 и р55, ибо в этих случаях возможны, или инфицирование, или ложноположительный результат. В подобных случаях, если обследуемый не относится к группе риска, а повторный анализ не дает нарастания титра антител, скорее всего человек не инфицирован. Окончательное же решение вопроса о диагнозе возможно только при проведении более высокочувствительных, экспертных методов исследования: пероксидазной цепной реакции, ДНК-зондов или культивирования вируса. Среди серологических методов в случае неопределенных результатов ИБ используется в качестве экспертной диагностики радиоиммуно-преципитация (РИП).
|
|
В основе РИП лежит использование белков вируса, меченых радиоактивным йодом, а преципитаты выявляются с помощью бета-счетчиков. К недостаткам метода относятся дорогостоящая аппаратура, необходимость оборудования для этих целей специальных помещений.
Более доступен метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием специальных клеточных линий, инфицированных ВИЧ. Чаще всего используют клеточные линии MOLT, H9, CEM и др. Клетки фиксируют на предметных стеклах с помощью ацетон-метанола, убивающего вирус, но сохраняющего его поверхностные антигены. С последними взаимодействуют антитела сыворотки инфицированного.
Интерпретация серодиагностики ВИЧ-инфекции представляет иногда определенные трудности. Так, при применении твердофазного ИФА (ELISA) необходимо ставить реакцию параллельно набором тестов (ELISA Biatest Mixte, ELISA Abott Mixte, ELISA Behring Mixte), ибо встречаются ситуации, когда два теста ELISA могут быть отрицательными, а третий в последующем положительным при повторном обследовании, что подтверждает диагноз ВИЧ-инфекции. Аналогичная ситуация наблюдается при использовании теста Western-Blot.
Большие трудности интерпретации результатов при перекрестных реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии. В первой ситуации при повторном исследовании через определенный промежуток времени антитела не выявляются, а во втором в иммуноблотте появляются новые полосы, свидетельствующие о появлении антител к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя динамику ответной иммунной реакции на антигены вируса.
В США применяется несколько тестов, позволяющих с достаточной степенью достоверности выявлять ВИЧ-инфицированных:
- ELISA - тест (твердофазный иммуноферментный анализ) выявления первого уровня, характеризуется большой чувствительностью, хотя и меньшей специфичностью перед нижеследующими,
- Western-blot (иммунный блотинг) - весьма специфичный и наиболее используемый тест, позволяющий дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ- 2,
- антигенемия р25 - тест, эффективный в начальных стадиях заражения.
Внедрение метода полимеразной цепной реакции существенно обогатили лабораторную диагностику вирусных инфекций, в том числе и ВИЧ-инфекции. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является циклическим процессом увеличения в геометрической прогрессии копии ограниченного синтетическими олигонуклеотидами (праймерами) определенного специфического фрагмента ДНК, протекающей под воздействием термостабильной ДНК-полимеразы при строго заданных температурных и временных характеристиках (White T.J. et al.,1989). Чувствительность ПЦР зависит от специфичности, с которой олигонуклеотиды синтезируют необходимый участок ДНК по отношению к другим неспецифическим участкам нуклеиновой кислоты. Использование различных вариантов ДНК - ДНК-гибридизации с олигонуклеотидными зондами, имеющих ту или иную метку (радиоактивную, флюоресцентную и т.д.) значительно увеличивает чувствительность и специфичность определения продуктов амплификации. Метод гибридизации нуклеиновых кислот весьма высокоспецифичен, однако, без проведения амплификации не всегда чувствителен, ибо в крови не велико количество инфицированных клеток. Сочетание двух методов позволило проводить анализ с минимальным количеством материала. В ПЦР может быть использована ДНК, выделенная из свежеполученного материала (кровь, ткани), а также из замороженного, высушенного или фиксированного.
Основным клинико-лабораторным показателем диагностики СПИДа среди ВИЧ-инфицированных в повседневной жизни стало определение содержания CD4+ лимфоцитов: уменьшение уровня ниже 200 клеток/мм является основным критерием постановки диагноза СПИД. Считается, что все ВИЧ-инфицированные лица с количеством CD4+лимфоцитов 200 клеток/ мм и ниже нуждаются как в противовирусной терапии, так и профилактике пневмоцистной пневмонии. И хотя у 1/3 ВИЧ-инфицированных с количеством СD4+ лимфоцитов менее 200 клеток/мм отсутствуют клинические проявления, опыт показал, что у них симптомы развиваются в ближайшие 2 месяца, поэтому они все расцениваются как больные в стадии СПИДа.
В специализированных лечебных учреждениях, в странах с высоким экономическим потенциалом обычно используют комбинацию нескольких лабораторных тестов.
Таким образом, ранняя и/или своевременная клинико-лабораторная диагностика различных стадий ВИЧ-инфекции (СПИДа) практически возможна, хотя и является труднорешаемой задачей, поскольку требует хорошего знания практически всех разделов клинической медицины.
Литература