Антагонистическая активность пробиотических штаммов: факторы регулирования

Аннотация:

Антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре ПиУПМ – важнейшая характеристика пробиотических штаммов. В ходе работы изучен антимикробный спектр действия штаммов Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus из молочнокислых продуктов как

Ключевые слова: пробиотики, пробиотические культуры (микроорганизмы), молочнокислые бактерии МКБ, пробиотический эффект, функциональные продукты питания ФПП, патогенная и условно-патогенная микрофлора ПиУПМ, антибиотическая (антагонистическая, антимикробная, ингибиторная) активность как живых микроорганизмов и экзо-метаболитов в культуральной жидкости, так и в экстрагирующей смеси бактерий, содержащих бактериоцины, другие эндо-метаболиты специфического антагонизма

Как известно, МКБ тесно ассоциированы с пищевыми продуктами и имеют «GRAS» статус (Generally Recognized As Safe), что определяет их как абсолютно безопасные для здоровья человека и животных. В разных странах мира кисломолочные продукты пользуются заслуженной популярностью, поскольку многовековой опыт показал, что они оказывают благоприятное влияние на человеческий организм.

Пробиотические культуры, включаемые в состав кисломолочных, функциональных продуктов питания ФПП, или лекарственных препаратов пробиотиков, положительно влияют на здоровье потребителя на уровнях неспецифического, специфического антагонизма к ПиУПМ, клеточного и гуморального иммунитета [1, 2]. В настоящее время наука о пробиотиках рассматривает однозначный вывод о том, что, чем больше биомасса живых пробиотических культур, тем выше пробиотический эффект, как атавизм, или правило с исключениями [3].

Пробиотики – иммунобиологические лекарственные препараты, которые содержат живые или (что, сравнительно ново в пробиотической микробиологии) инактивированные апатогенные микроорганизмы (эубиотики), обладающие антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, а также продукты их жизнедеятельности или факторы роста для микробов нормофлоры (пребиотики) и их рациональные комбинации друг с другом (синбиотики). Эта группа препаратов оказывает положительные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма человека благодаря стабилизации и оптимизации функций его нормальной микрофлоры и антибиотической активности по отношению к ПиУПМ [4].

Антагонистическая активность бактерий осуществляется с помощью разных (зачастую очень тонких) молекулярных механизмов, а ее проявление зависит от ряда факторов, среди которых прежде всего следует назвать разнообразие взаимодействий антагониста и его жертвы в конкретных условиях внешней среды. Используются также термины антимикробная, ингибиторная

антибиотическая активность [5-8] в понимании способности пробиотических микроорганизмов образовывать антибиотические вещества и за счет этого оказывать бактерицидное и бактериостатическое действие на вредную микрофлору.

Сложность вопроса определяет сужение данной проблемы в представляемом научно-практическом исследовании до молочнокислых бактерий МКБ (прежде всего Lactococcus и Lactobacillus), часто включаемых в кисломолочные продукты и ФПП на молочной и безмолочной основе и её систематизацию по двум уровням действия: неспецифический антагонизм метаболитов (1), специфический антагонизм (2), а также регулирование факторов влияния на них: соотношение живые/инактивированные микроорганизмы, рН и др.

1. Неспецифический антагонизм на технологическом уровне проявляется в образовании молочной, пропионовой, уксусной и других органических кислот, снижении рН, создании анаэробных условий и конкуренцией за лактозу и проявляется в отношении большинства вредных бактерий. Ингибирующее действие органических кислот, по сравнению с таковым же для неорганических кислот связывают с более легким проникновением первых внутрь бактериальной клетки, что вызывает необратимые изменения цитоплазмы. Различные микроорганизмы по-разному реагируют на кислотность среды обитания. Например, при рН ниже 5.0 молочная кислота хорошо ингибирует рост многих бактерий, в том числе спорообразующих Clostridium, хуже подавляет развитие микроскопических грибов и дрожжей [10].

2. Природа специфического антагонизма, в частности к стафилококкам изучена еще в 50-80 годах прошлого века. В ряде случаев она представляет собой окислительный эффект вырабатываемой перекиси водорода в пределах концентраций, подавляющих вредные бактерии (выше 8 мкг/мл), но при этом не подавляющих развитие самих микроорганизмов многокомпонентной закваски (ниже 17 мкг/мл). В присутствии кислорода МКБ способны образовывать больше Н₂О₂ посредством действия НАДН-оксидазы и супероксиддисмутазы. В отсутствии гема в среде МКБ не образуют каталазу, что позволяет накапливаться Н₂О₂. Эффект Н₂О₂ может усиливать лактопероксидаза и тиоцианат, имеющиеся в природных местообитаниях МКБ, например, в молоке. Вследствие накопления бактериями Lactococcus и Lactobacillus перекисей наблюдается ингибирование развития золотистого стафилококка Staphylococcus aureus, а также грамотрицательных бактерий, включая разные виды Pseudomonas.

Пироролидон-5-карбоксильная кислота образуется лишь некоторыми видами МКБ, такими как: Lactobacillus casei subsp. casei, L. casei subsp. рseudoplantarum и обладает бактерицидной активностью в отношении Bacillus subtilis и Enterobacter clоacae [10].

Диацетил – метаболит ароматобразующих культур. Диацетил образуется в процессе превращения цитрата через пируват. Максимальная активность диацетила наблюдается при слабокислом значении рН. Он активен, в основном, против грамотрицательных бактерий, принадлежащих к родам Salmonella, Yersinia, Escherichia и Aeromonas, а также грамположительных, относящихся к роду Bacillus.

Реутерин (β-ОН-пропионовый альдегид) образуется в анаэробных условиях из глицерола бактериями Lactobacillus reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. collinoides и L. corniformis. Реутерин обладает антагонистической активностью против многих патогенных микроорганизмов: энтеробактерий (Salmonella, Shigella), бактерий родов Clostridium, Staphylococcus, Listeria, дрожжейрода Candida и простейшихрода Trypanosoma. Широкий спектр действия обусловлен тем, что реутерин связывается с SH-группами ферментов, в том числе и с рибонуклеотидредуктазой.

Проявление фунгицидной активности является не характерным физиологическим свойством для МКБ. Однако в последнее время появилось ряд сообщений об образовании некоторыми штаммами МКБ специфических фунгицидных веществ. Известны следующие типы фунгицидных веществ, образуемых МКБ: 1) дикетопиперазины или циклические дипептиды; 2) гидроксипроизводные жирных кислот; р -гидроксифениллактат; 3) бензойная кислота; 4) метилгидантоин; 5) мевалонолактон; 6) пентоцин; 7) реутерин. Первые три типа веществ в литературе охарактеризованы более полно [10, 11].

Среди других механизмов специфического антагонизма к технически-вредной и ПиУПМ [3, 4] - выработка бактериоцинов. Изучена, в частности, регуляция синтеза бактериоцина, продуцируемого рекомбинантным штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis F-116. Показано, что при уменьшении содержания КН₂РО₄, от 2.0 до 1.0 или до 0.5% в базовой ферментационной среде, содержащей (в %): глюкозу-1.0, NaCl-0.2, MgSO₄-0.02 и дрожжевой автолизат - 35 мг % по азоту аммония, бактериоцинпродуцирующая активность штамма снижалась. При замене в базовой среде с 2% КН₂РО₄ глюкозы как качества источника углерода на сахарозу наблюдали увеличение антибиотической активности на 26%, а при добавлении в среду изолейцина - на 28.5%. Внесение в ферментационную среду с 1% КН₂РО₄ 70 мг % по азоту аммония дрожжевого автолизата, 2% сахарозы и 0.1% изолейцина способствовало лучшему накоплению биомассы и повышению уровня бактериоцинпродуцирующей активности штамма L lactis subsp. lactis F-116 в 2.4 раза. [12, 13]

Исследование нами антибиотической активности 14 штаммов Lactobacillus (табл. 1, рис. 1, рис. 2) проводили в микробиологическом боксе лаборатории Биофака МГУ методом диффузии в агар с измерением зон подавления роста тест-культуры в мм [14].

При изучении спектра биологического действия в качестве тест-культур использовали:

грамположительные бактерии: Staphylococcus aureus 52, Micrococcus flavus NCTC 8340; грамотрицательные бактерии: Escherichia coli ATCC 25922, Protus vulgaris-28; микроскопические грибы и дрожжи: Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans INA 00763.

Определяли уровень антибиотической активности как живых микроорганизмов в культуральной жидкости, так и в экстрагирующей смеси (экстракте) бактерий, содержащих бактериоцины, другие эндо-метаболиты специфического антагонизма (с нейтрализацией кислот до рН 5,5). Культуральная жидкость, в отличие от экстракта содержит живые клетки пробиотика, молочную, др. органические кислоты, экзометаболиты, выделяющиеся МКБ при жизнедеятельности. В результате экстракции разрушается клеточная стенка микроорганизмов и освобождаются связанные с мембранами бактериоцины, эндометаболиты (содержащиеся внутри клетки), нейтрализуются кислоты.

Таблица 1 - Исследованные культуры лактобацилл

Рис.1 Ингибиторная активность культуральной жидкости и экстрактов культур лактобацилл на Staphylococcus aureus

Рис. 2 Ингибиторная активность культуральной жидкости и экстрактов культур лактобацилл на Proteus vulgaris

Результаты исследований и анализа данных:

1. Изученные штаммы Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus обладают широким спектром антимикробного действия: подавляют рост грамм положительных бактерий (Staphylococcus aureus, Micrococcus flavu), грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Proteus vulgaris) микроскопических грибов Aspergillus niger и Candida. Albicans. Факторы, способствующие активному накоплению биомассы клеток, в-основном, одновременно усиливают их антагонистическую активность. Самыми активными из изученных штаммов оказались штаммы № 14, 19 Lactobacillus acidophilus, ВНИИМИ.

2. Активность штаммов Lactobacillus acidophilus на грамотрицательной бактерии проявляется как в культуральной жидкости за счет накопления экзометаболитов, не связанных с клеточной стенкой, так и в экстрагирующей смеси с рН 5,5. Из семи штаммов L. delbrueckii ssp. bulgaricus наиболее активен штамм № 8, 11, 12. Антибиотическая активность была выявлена и у других штаммов этого вида, но, в основном, только в экстрактах. Можно предположить, что антибактериальный метаболит связан с клеточной стенкой продуцента и является бактериоцином.

3. Фунгицидная активность лучше проявляется в культуральной жидкости (при наличии живых клеток и их метаболитов) у обоих видов лактобацилл.

4. Уменьшение кислотности продукта способствует лучшей антибиотической активности против Salmonella, Yersinia, Escherichia (посредством лучшей выработки диацетила, адьдегидов, кетонов, реутерина - в случае аромотообразующих штаммов).

5. Увеличение кислотности продукта (уменьшение рН) – усиливает антагонизм против спорообразующих Clostridium, Bacillus энтеробактерий (Salmonella, Shigella), бактерий родов Staphylococcus, Listeria, дрожжей рода Candida (фунгицидной) и простейших рода Trypanosoma (за счет неспецифического антагонизма молочной и др. органических кислот).

Литература:

1. Зудина Н.А. Современные представления о пре- и пробиотиках, их роль в поддержании иммунологического гомеостаза // БМИК. 2014. №5. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/

2. Полянская И.С., Семенихина В.Ф., Забегалова Г.Н. Независимая экспертиза кисломолочных продуктов по эффективности пробиотической активности // Молочная промышленность, № 7 - 2014 г. – С 60-61.

3.Чичерин И.Ю., Погорельский И.П. и др. Кишечная микрофлора. Взгляд изнутри. – ВятГУ. - 2013 г. – 149 с.

4. ОФС. Пробиотики. Министерство здравоохранения Российской Федерации. – 2015 г. – 13 с.

5. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Антагоничтическая активность молочнокислых культур LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS по отношению к тест-штаммам ESCHERICHIA COLI. - Известия Алтайского государственного университета. 2011. № 3-2. С. 19-22.

6. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Сравнительный анализ методов определения антагонистической активности молочнокислых бактерий. - Известия Алтайского государственного университета. 2012. № 3-1. С. 41-44.

7. Ермоленко Е. И. Молочнокислые бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту. Диссертация на соис. ст. д.м.н. – СПб, 2012. – 205 с.

8. Полянская И.С., Семенихина В.Ф. Антибиотическая активность молочнокислых бактерий к стафилококкам. - Молочная промышленность. 2014. № 5. С. 48-49.

9. Полянская И.С., Тераевич А.С., Топал О.И., Семенихина В.Ф. Антибиотическая активность молочнокислых культур к сальмонеллам // Молочная промышленность. 2015. № 1. С. 56-57.

10. Полянская И.С. Профилактические действие пробиотических культур в кисломолочных продуктах - Санэпидконтроль. Охрана труда - №1/ - 2015. https://www.profiz.ru/sec/1_2015/probiotiki_kislomol/

11. Стоянова Л.Г., Устюгова Е.А., Нетрусов А.И. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства. - Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 3. С. 259.

12. Stoyanova L.G., Levina N.A. Components of fermentation medium regulate bacteriocin synthesis by the recombinant strain Lactococcus lactis subsp. lactis F-116. - Microbiology (Mikrobiologiya). 2006. Т. 75. № 3. С. 286-291.

13. Ustyugova E.A., Stoyanova L.G., Fedorova G.B., Katrukha G.S. Investigation of the antibiotic complex produced by Lactococcus lactis subsp. lactis 194, Variant K. - Microbiology (Mikrobiologiya). 2011. Т. 80. № 5. С. 657-663.

14. Стоянова Л.Г. Отчет №1-09/15 от 01 апреля 2015 г Определение антимикробного спектра действия новых штаммов Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, выделенных из молочнокислых продуктов функционального назначения по теме: «Нутрициологический и пробиотический потенциал функциональных продуктов питания, кормов и воды». Руководитель И.С. Полянская (№ госрегистрации 01201354138 Министерство сельского хозяйства Российской Федерации).