Назначение серологических реакций.
1. Определение неизвестных Аг с помощью известных антител
2. Определение неизвестных антител с помощью известных антигенов
Ложно положительные реакции могут проявляться при тяжелых заболеваниях – эндокринных, у беременных, при гепатитах, алкогольных интоксикациях, красной волчанки и тд.
Классификация
Серодиагностика
Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.
ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия — неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.
При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)
Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);
- концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).
В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.
ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система — сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).
В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченые АГ и АТ (р. иммунофлюорес-ценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).
4. РА механизм, применение.
Агглютинация — это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток (корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.
РА применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний (реакция Видаля — при брюшном тифе и паратифах, р. Вейгеля — при эпидемическом сыпном тифе, р. Райта — при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.
В РА участвуют 3 ингредиента:
1) корпускулярный АГ (агглютиноген);
2) антитело (агглютинин);
3) изотопический раствор хлорида натрия (электролит).
Антигены — взвесь живых и убитых микроорганизмов.
Идентификацию вида (серотила) микроба, выделенного от больного или внешней среды, определяют по известному антителу (диагностической иммунной сыворотки). Положительный результат реакции укажет на то, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления иммунной диагностической сыворотки.
Для приготовления взвеси испытуемого микроорганизма суточную агаровую культуру бактерий смывают 1-2 мл физиологического раствора, доводя концентрацию до 2-х млрд. микробных клеток в 1 мл.
При определении неизвестных антител в сыворотке крови больного или реконвалесцента принято пользоваться заранее заготовленными диагностикумами — микробами, убитыми формалином, спиртом, прогреванием, которые готовятся в производственных условиях.
При лабораторной диагностике некоторых инфекционных заболеваний, например, брюшного тифа и паратифов, имеет значение раздельное определение О- и Н-антител в исследуемых сыворотках, т.к. время их появления у больных и сохранение у реконвалесцентов различно. Для этих исследований необходимо располагать соответственно О- и Н-диагностикума-ми. Для приготовления жгутикового Н-антигена к взвеси агаровой культуры микробов в физиологическом растворе добавляют 0,2 % формалина и выдерживают при 37 °С в течение 24 часов О-диагностикум получают прогреванием пробирки со смывом агаровой культуры соответствующего микроба в кипящей водяной бане в течение 1,5-2 часов.
Антитела (сыворотки):
а) Испытуемая сыворотка от больного или реконвалесцента получается из крови, взятой стерильно из локтевой вены в количестве 1-2 мл в стерильную пробирку; оставляют на 1 час при комнатной температуре или при 37 °С на 30 минут. Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки бакпетлей, затем пробирку оставляют в холодильнике на ночь. Кровь цен-грифугируют и отсасывают сыворотку.
Готовят последовательно, чаще двукратные разведения сыворотки. Обычно разводят в соотношении от 1:50 до 1 800.
Количество неизвестных агглютинирующих антител в сыворотке оценивается по титру — наибольшему разведению сыворотки, которое еще дает реакцию агглютинации (выпадение осадка — агглютинат).
б) Агглютинирующая диагностическая иммунная сыворотка готовится в производственных условиях путем иммунизации кроликов (реже лошадей) соответствующими антигенами (взвесью живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов и т.д.).
Полученную иммунную сыворотку, определив его титр, разливают по ампулам с добавлением консерванта. Иногда употребляют высушенную сыворотку.
Изотонический раствор хлорида натрия — 0,85 % химически чистой поваренной соли, рН 7,2-7,4.
РА должна сопровождаться контролем АГ и контролем АТ (сыворотки) для исключения спонтанной самопроизвольной агглютинации, которая может наступить в 2-х случаях:
а) при потере антигеном специфичности (он диссоциирован на 5-формы в Р);
б) при изменении рН реакции в кислую сторону.
Существует два основных метода постановки РА:
1) ориентировочная РА на предметном стекле, наступающая в течение нескольких минут. Применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ;
2) развернутая РА в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37 «С и на следующий день стояния при комнатной температуре. Применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.
РА входит в группу методов, в которых реакция протекает в две фазы:
1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза)
2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглю-тината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).
Антигены поливалентны, а антитела — двух (ИгО) или более (ИгМ) валентны. Соединение их приводит к образованию макроконгломератов, выпадающих в осадок. Причем характер осадка зависит от свойств антигена: жгутиковые бактерии, имеющие Н-АГ. склеиваются жгутиками, при этом образуются крупнохлопчатый осадок^ который наступает а течение двух часов при 37 «С, У безжгутиковых бактерий, имеющих соматический О-АГ, происходит склеивание непосредственно самих клеток и образование мелкозернистого осадка. Такой осадок образуется медленно, в течение 18-24 часов при комнатной температуре.
Достоинства РА: простота постановки и экспрессность.
Недостатки: уступает по специфичности и чувствительности.
5. Нагрузочные РА (стр. 149 в методе)
6. РП механизм применение (стр. 153 метода)
7. РСК механизм применение
РСК отличается высокой чувствительностью и специфичностью и применяется для;
1) серологической диагностики инфекционных заболеваний (р. Вассермана — при сифилисе, р. Борде-Жангу — при хронической гонорее и др.);
2) идентификации бактерии и др. микробов.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых участвуют, кроме АГ- АТ-, ещё гемолитическая система (р. гемолиза), выявляющая результат реакции.
РСК проводится в два этапа при участии двух систем:
1) Первая система — АГ+АТ-(-комплемент — обуславливает связывание комплемента в том случае, если АТ соответствует АГ, В случае же несоответствия АТ и АГ комплемент остаётся свободным;
2) Вторая система (индикаторная) — гемолитическая сыворотка (гемолизины) + эритроциты — показывает исход реакции в первой системе: в случае положительного результата реакции в первой системе (образования комплекса АГ+АТ+комплемент) во второй системе не произойдет гемолиза ввиду отсутствия комплемента (эритроциты оседают на дно пробирки). В случае отрицательного результата в первой системе вторая сопровождается гемолизом, т.к. образуется комплекс эритроциты + гемолизины + комплемент.
Компоненты реакции:
1) испытуемая сыворотка (предварительно инактивируют нагреванием при 56 «С в течение 30 минут);
2) антиген (изготавливается из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных АГ, гаптенов, экстрактов тканевых липидов);
3) комплемент;
4) гемолитическая сыворотка;
5) 3 % взвесь эритроцитов барана,
6) физиологический раствор;
7) контрольная сыворотка.
Комплемент, В качестве комплемента в РСК применяют свежую и высушенную сыворотку морской свинки, т. к. в крови морской свинки комплемент содержится в наибольшем количестве и присутствует постоянно, чем у др. животных. Перед постановкой РСК следует проводить титрование комплемента в реакции гемолиза (эритроциты барана, гемолитическая сыворотка, комплемент, физ. раствор) и определение рабочей дозы.
Титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки.
Рабочая доза комплемента — количество комплемента, которое выше тира на 25 %.
Гемолитическая сыворотка готовится путём иммунизации кроликов 50 % взвесью эритроцитов барана. Полученную сыворотку инактивируют нагреванием при 56 °С. Определяют титр и рабочую дозу.
Титр сыворотки — максимальное разведение сыворотки, которая вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии комплемента. В качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.
8. ИФА принцип метода практическое применение
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидаза является раствор ортофенилдиамина.
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА. Сущность ИФА аналогична РИА.
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.
К преимуществам ИФА следует отнести:
- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;
- простота методов оценки реакции;
- стабильность конъюгатов;
- легко поддаётся автоматизации.
Однако, по сравнению с РИА, отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
Конкурентный тип.
Назначение.
Предназначена для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (НВз Ад) в сыворотках и плазме крови при диагностике вирусного гепатита В и определения носительства НВ5 Ад.
Компоненты:
1) исследуемый материал сыворотка или плазма крови;
2) антитела к НВз Ад, адсорбированные на поверхности лунки полистиролового микропланшета;
3) коньюгат — мышиные моноклониальные антитела к НВз Ад, меченые пероксидазой,
4) ортофенилендиамин (ОФД) -субстрат;
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
— положительная (сыворотка с НВе Ад);
— отрицательная (сыворотка без НВз Ад). Ход работы
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2) Инкубация 1 час при 37 «С.
3) Отмывание лунок.
4) Внесение конъюгата.
5) Инкубация 1 час при 37 «С.
6) Отмывание лунок.
7) Внесение ОФД. При наличии НВз Ад раствор а лунках желтеет.
Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых НВз Ад.
Механизм
Реакция протекает в три фазы:
1) НВз Ад исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (НВз Ад — агл\ НВз АТ).
2) Антитела НВз Ад, меченые пероксидазой, связываются с оставшимися свободными детерминантами НВз Ад комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ {ап!1 НВз АТ-НВз Ад-ап(1 НВз АТ, меченые пероксидазой).
3) ОФД взаимодействуют (с пероксидазой) комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
Непрямой тип
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ-инфекции.
Цель: серологическая диагностика ВИЧ-инфекции — обнаружение антител к антигенам ВИЧ, Компоненты:
1) исследуемый материал — сыворотка крови;
2) синтетические пептиды, имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: др 120 и др 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТкАТ-м);
4) ОФД;
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
- положительная;
- отрицательная.
Ход работы
1) Внесение контрольных и исследуемых сывороток. 2} Инкубация 30 минут при 37 «С.
3) Отмывание.
4) Внесение антиглобулиновой сыворотки, меченой ферментом.
5) Инкубация 30 минут при 37 «С.
6) Отмывание.
7) Внесение ОФД. Механизм
Реакция протекает в 3 фазы:
1) Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (др 120 и др 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ {АТ к ВИЧ — АГ ВИЧ).
2) Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.
3) ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
9. РИФ принцип метода, практическое применение.
В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.
10. Иммуноблоттинг, практическое применение
Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.
Реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой (in vivo)
1. Реакция нейтрализации на животных применяется:
- для определения специфической активности анатоксинов (дифтерийный, столбнячный и др.) по стандартной антитоксической сыворотке и по опытной дозе токсина. Активность анатоксинов выражается в единицах связывания (ЕС), ЕС -количество анатоксина, которое целиком связывается с ШЕ/мл антитоксической сыворотки;
- для идентификации бактерий (возбудители газовой анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма и др.) по стандартной антитоксической сыворотке;
- для титрования антитоксических сывороток (противодифтерийная, противостолбнячная и др.) по стандартному токсину. Титрование — это определение количества антитоксинов в 1 мл сыворотки. Специфическая активность сывороток выражается в международных антитоксических единицах (МЕ). 1МЕ —минимальное количество сыворотки, которое способно нейтрализовать определенную дозу токсина, выражающуюся в стандартных единицах: смертельных, некротических или реактивных дозах, в зависимости от вида токсина и способа титрования.
Титрование антитоксических сывороток может производиться следующими методами:
Метод Эрлиха. Титрование антитоксических сывороток по известной смертельной (опытной) дозе токсина.
Проводится в 2 этапа:
1) определение опытной дозы токсина. Смертельная доза — это количество токсина, которое в смеси с 1МЕ стандартной сыворотки вызывает гибель 50 % взятых в опыт животных;
2) к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, инкубируют 45 минут и вводят животным. По результатам производят расчет
титра сыворотки.
Метод Ремера. Титрование антитоксических сывороток по известной некротической дозе токсина. Проводится в 2 этапа:
1) определение опытной некротической дозы токсина путём внутрикожного введения морской свинке различного количества токсина со стандартной сывороткой. Некротическая доза токсина — это его минимальное количество, которое в смеси с 1/50МЕ стандартной сыворотки вызывает на месте внутрикожного введения некроз на 4-5-и день;
2) к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина и вводят внутрикожно морской свинке.
По результатам производят расчёт титра сыворотки. Так титруется противодифтерийная сыворотка.
12. Реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой ин витро
Этот тип иммунологической реакции основан на способности специфических антител — антитоксинов подавлять биологическую активность экзотоксинов бактерий.
Реакции нейтрализации токсина антитоксической сывороткой in vitro
1) Реакция флокуляции. Феномен флокуляции — помутнение — внешнее проявление образования комплекса экзотоксин (анатоксин) + антитоксин в оптимальных количественных соотношениях ингредиентов.
Реакция применяется:
- для определения специфической активности токсинов (анатоксинов) по стандартной антитоксической сыворотке (МЕ/мл), которая обозначается Ыглез?1осси!а1юп15 (и — порог флокуляции) или иммуногенной единицей (ИЕ). и — это то количество токсина (анатоксина), которое даёт интенсивную, ^-инициальную» флоккуляцию с 1МЕ сыворотки;
- для титрования антитоксических сывороток по известному анатоксину или токсину (метод Рамона). Активность сывороток выражается в МЕ/мл принимается то минимальное количество сыворотки, которое даёт интенсивную «инициальную» флокуляцию с Ш анатоксина (токсина). Например, эта реакция применяется для определения активности дифтерийного, столбнячного, ботулинического, гангренозного анатоксинов и титрования противодифтерийной, противостолбнячной, протиаоботулинической, прогивогангренозной и др. антитоксических сывороток.
13. РНГА принцип метода, применение
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обычных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам.
РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабатывают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.
Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пуговицы»
14. Реакция преципитации в геле (методичка стр. 154)
15. Прямой и непрямой РИФ
В качестве метки используются светящиеся флюорохром-ные красители (изотиоционат флюорисцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний — для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглоткой и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ-ла к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию — свечение.
Компоненты непрямой РИФ:
1) исследуемый материал;
2) специфическая антисыворотка;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ-ла против иммуноглобулина), меченая флюорихромом;
4) Изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем — меченой антиглобулиновой сывороткой.
Светящиеся комплексы АГ-АТ — меченые АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Также выделяют 4-компонентную разновидность непрямой РИФ, когда дополнительно вводится комплемент (сыворотка морской свинки). При положительной реакции образуется комплекс АГ-АТ — меченые — АТ-комплемент.