Микроскопия. Устройство оптического микроскопа.
В настоящее время существует множество моделей оптических микроскопов, однако все они имеют принципиально одинаковое строение. Условно можно выделить в микроскопе механическую и оптическую части.
Механическая часть обеспечивает крепление оптики, позволяет правильно разместить препарат и произвести настройку. К этой части относится станина, на которой закреплен штатив, поддерживающий тубус и револьверную насадку для объективов. К штативу крепится также предметный столик, на который помещают объект. Для удобства перемещения объекта на столике может быть установлен препаратоводитель. Настройка обеспечивается перемещением оптической системы относительно объекта с помощью макровинта (для грубой настройки) и микровинта (для тонкой настройки и послойного просмотра препарата). В разных моделях микроскопов эти винты могут либо перемещать тубус относительно неподвижного предметного столика, либо наоборот поднимать и опускать столик.
Оптическая часть микроскопа состоит из объектива (их обычно устанавливается несколько, с разным увеличением и апертурой), окуляра (которых может быть от 1 до 3) и конденсора с ирисовой диафрагмой.
Источником света может служить электроосветитель или зеркало, собирающее свет от внешнего источника.
Объектив.
Основной и наиболее сложной частью оптической системы микроскопа является объектив. Объектив – это сложная многолинзовая короткофокусная система. Передняя линза объектива, обращенная к препарату плоской стороной называется фронтальной. Именно эта линза вносит основной вклад в увеличение объектива, другие же линзы предназначены для коррекции аберраций. Аберрация (лат. aberratio «уклонение, удаление, отвлечение», от лат. aberrare (лат. ab- «от» + лат. errare «блуждать, заблуждаться») — «удаляться, отклоняться»), это ошибка или погрешность изображения в оптической системе, вызываемая отклонением луча от того направления, по которому он должен был бы идти в идеальной оптической системе.
|
|
Аберрации делятся на монохроматические, то есть присущие монохромным пучкам лучей, и хроматические.
Монохроматические аберрации связаны с тем, что преломляющие поверхности не могут собрать в точку все лучи, падающие под большими углами. В результате, вместо изображения точки формируется некая размытая фигура, называемая фигурой рассеяния. Из-за этого падает четкость изображения всего наблюдаемого объекта.
Существует пять наиболее важных типов монохроматических аберраций.
Это сферическая аберрация, кома, астигматизм, кривизна поля (поверхности) изображения и дисторсия.
Сферическая аберрация — недостаток оптического изображения, заключающийся в том, что световые лучи, прошедшие вблизи оптической оси, и лучи, прошедшие через отдалённые от оси части оптической системы (например, линзы), не собираются в одну точку. Сферическая аберрация может быть практически почти полностью устранена применением специально рассчитанных комбинаций линз.
Кома — недостаток оптического изображения (изображение точки имеет вид продолговатого несимметричного пятнышка), возникающий при косом прохождении световых лучей через оптическую систему. Кома может рассматриваться как сферическая аберрация лучей, проходящих не через оптическую ось системы. Оптические системы с исправленными коматической и сферической аберрацией называются апланатами.
|
|
Астигматизм. Если при прохождении оптической системы сферическая световая волна деформируется и перестаёт быть сферической, то пучок лучей становится сложным: лучи пересекаются не в одной точке, а в двух взаимно перпендикулярных отрезках прямой линии, расположенных на некотором расстоянии друг от друга. Такой пучок называется астигматическим, а само явление — астигматизмом. Оптические системы с исправленным астигматизмом называются анастигматами.
Кривизна поля изображения — аберрация, в результате которой изображение плоского объекта, перпендикулярного к оптической оси объектива, лежит на поверхности, вогнутой либо выпуклой к объективу. Эта аберрация вызывает неравномерную резкость по полю изображения. Поэтому, когда центральная часть изображения фокусирована резко, то его края будут лежать не в фокусе и изобразятся нерезко. Если установку на резкость производить по краям изображения, то его центральная часть будет нерезкой.
Аберрация оптической системы, называемая дисторсией, выделяется неодинаковостью линейного увеличения в пределах всего поля изображения и приводит к нарушению геометрического подобия между объектом и его изображением.
Оптические системы могут обладать сразу несколькими видами монохроматических аберраций.
Хроматические аберрации связаны с паразитной дисперсией света, проходящего через оптическую систему (фотографический объектив, бинокль, микроскоп, телескоп и т. д.). При этом белый свет разлагается на составляющие его цветные лучи, в результате чего изображения предмета в разных цветах не совпадают в пространстве изображений. На практике это приводит к тому, что объект выглядит окрашенным, когда в действительности таковым не является. Хроматические аберрации у объективов могут быть устранены, что особенно важно для микрофотографирования. Система линз, в которой сближены фокусы двух (например, синих и жёлтых) лучей, называется ахроматической, а при сближении фокусов трёх лучей — апохроматической, четырёх - суперахроматической.
|
|
По характеру оптической коррекции аберраций объективы, используемые в микроскопии делятся на ахроматы, апохроматы, планахроматы, планапохроматы.
Ахроматы – относительно просто устроенные объективы, устраняют сферическую аберрацию и частично хроматическую (сближены фокусы 2 длин волн). Маркировка отсутствует или Achro
Апохроматы – сложно устроенные объективы, полностью устраняющие сферическую и практически полностью – хроматическую аберрацию. Маркировка Apo.
Планахроматы – сложно устроенные объективы, полностью устраняющие сферическую аберрацию, и кривизну поля зрения – т.е. при использовании данных объективов резкость изображения в центре и по краям изображения одинакова. Хроматическая аберрация устраняется лишь частично. Маркировка Plan, План, Pl.
Планапохроматы – наиболее сложные и дорогие объективы, применяемые в микрофотографии. Поле зрения выровнено, полностью устранены сферическая и хроматическая аберрация. Маркировка PlanApo.
Существуют также объективы, не устраняющие полностью, но существенно уменьшающие кривизну поля зрения – такие объективы называются семипланаты и маркируются как SP.
Для возможности взаимозаменяемости у большинства современных объективов используется одинаковая резьба и парфокальное расстояние — расстояние между препаратом и посадочным местом объектива в микроскопе.
Расстояние от фронтальной линзы объектива до объекта называется рабочим расстоянием объектива. Как правило, чем большее увеличение дает объектив, тем меньше рабочее расстояние, и именно по этой причине при работе с объективами большого увеличения следует пользоваться только микровинтом.
Важнейшими характеристиками объектива являются увеличение и числовая апертура, указываемые на корпусе объектива через дробь. Числовая апертура играет важнейшее значение, т.к. влияет на разрешающую способность объектива.
Разрешающая способность – минимальное расстояние между двумя точками, пока они еще не сливаются в одну. От этой характеристики зависит степень детализации изображения, и способность увидеть мелкие детали структуры.
Разрешающая способность зависит от длины волны света, освещающего объект (λ), апертуры объектива и конденсора, и показателя преломления среды N. Улучшить разрешение можно, освещая объект более коротковолновым светом (синий или фиолетовый светофильтр), и снижая показатель преломления (иммерсионные системы).
Следует учитывать, что числовая апертура, указываемая на объективе, уже включает в себя значение показателя преломления среды, в которой данный объектив предназначен работать. Лучшие объективы имеют апертуру 1,4 и разрешение 0,12 мкм.
Максимальное полезное увеличение объектива ориентировочно равняется значению апертуры помноженному на 1000. Например, при использовании объектива с увеличением 100 и числовой апертурой 1,25 максимальное полезное увеличение составит 1250х. Использование в такой системе окуляра с увеличением более 12,5 не позволит различить каких-либо дополнительных деталей изображения, а только увеличит его размеры, при этом изображение постепенно будет терять резкость. Недостатком высокоапертурных объективов является низкая глубина резкости. В связи с этим, некоторые модели объективов снабжаются встроенной диафрагмой, позволяющей менять значение апертуры и маркируются I (Iris).
Кроме того, на корпусе объектива может указываться тип коррекции на длину тубуса (160 или ∞), и на толщину покровного стекла (обычно 0,17мм).
Для увеличения разрешающей способности за счет числовой апертуры пространство между линзой объектива и объектом наблюдения заполняют прозрачной жидкостью с требуемым коэффициентом преломления. Такие объективы называют иммерсионными. Обычно это делается для объективов с увеличением 40 и выше. Если объектив рассчитан на использование определенной жидкости, эксплуатировать его без нее или с другими жидкостями нельзя. В качестве жидкости чаще всего используют специальное кедровое или синтетическое масло (объектив маркируется Oil, черное кольцо), реже вода (W, белое кольцо) или глицерин (Gli, желтое кольцо).
В люминесцентных микроскопах используются особые объективы, которые изготавливаются из материалов с минимальной собственной люминесценцией и хорошо пропускающих ультрафиолет, так как часто подсветка ультрафиолетом ведется со стороны объектива. При этом объектив выполняет функции конденсора. Объективы для люминесцентных исследований маркируют FLUOR.
Окуляр.
Окуляр – часть оптической системы микроскопа, обращенная к глазу наблюдателя. Как правило, окуляры состоят из двух линз, при этом линза, обращенная к глазу называется глазной, а линза, направленная на объектив – коллектором или «собирательной». Существуют и более сложные окуляры, включающие в состав несколько линз.
Увеличение окуляров обычно варьирует в пределах 5-25 х. При подборе окуляра следует основываться на максимальном полезном увеличении для данной оптической системы.
Важнейшими характеристиками окуляра, кроме увеличения, является величина выноса зрачка и ширина поля зрения.
Величина выноса зрачка - это расстояние от линзы до глаза при которой полностью становится видно поле зрения. Данный показатель колеблется в пределах 5-30мм. Оптимальным считается вынос зрачка в пределах 10-20 мм. Эта величина может быть выше при использовании наблюдателем очков, или ниже, если очки не используются. При слишком маленьком выносе зрачка глазная линза часто загрязняется ресницами и невозможно использование очков. Пр слишком большой – изображение трудно удерживать неподвижным. В современных микроскопах данная величина указывается через дробь после увеличения.
Ширина поля зрения – угловой размер изображения, наблюдаемого в окуляр. Более широкое поле зрение считается предпочтительней. Широкопольные окуляры обозначаются буквой W и визуально отличаются большой площадью линзы.
Рис. 2 Широкопольный и узкопольный окуляры.
Конденсор.
В ранних моделях микроскопов использовали освещение с помощью естественных источников света, собирая лучи от них с помощью зеркала. Сейчас в большинстве микроскопов используется осветительный прибор, а для собирания лучей пользуются особым оптическим устройством – конденсором (лат. condense — сгущаю, уплотняю). Конденсор – короткофокусная система, обычно включающая 2-3 линзы, и расположенная под предметным столиком. Конденсор снабжен механическим винтом, двигающим его относительно столика вверх и вниз. В нем также имеется ирисовая диафрагма. Последняя предназначена для изменения апертуры конденсора, а не для регулировки яркости освещения. Следует иметь в виду, что при закрывании диафрагмы снижается разрешающая способность оптической системы, хотя изображение и становится контрастнее.
Конструкция высокоапертурных конденсоров сложнее, чем у низкоапертурных. При числовых апертурах до 0,1 применяют простые линзы; при апертурах 0,2—0,3 конденсоры состоят из 2 линз, выше 0,7—трёхлинзовые. Наиболее распространён конденсор из двух одинаковых плосковыпуклых линз, которые обращены друг к другу сферическими поверхностями для уменьшения сферической аберрации. Так как разрешающая способностьмикроскопа зависит от апертуры его конденсора, обычно применяются сложные двух или трёхлинзовые системы.
Как и высокоапертурные объективы, конденсоры с апертурой выше 0,95 должны использоваться в иммерсионной системе. При этом слой масла располагается между линзой конденсора и нижней стороной предметного стекла.
Правила работы с микроскопом.
Микроскоп является сложным оптическим прибором, поэтому существует ряд правил, которые необходимо соблюдать при работе с ним.
Порядок работы с оптическим микроскопом следующий:
После приготовления препарата, его следует поместить на предметный столик, при наличии препаратоводителя закрепить предметное стекло в держателе.
Далее, необходимо настроить освещение. При использовании встроенного осветителя (современные модели) выбирается невысокий уровень яркости. При использовании осветителя ОИ-32м, слегка ослабив прижимной винт и глядя в окуляр поворачивают патрон электролампы так, чтобы яркость освещения была максимальной и не наблюдалось дрожания света от колебаний нити накаливания. При использовании внешнего осветителя и зеркала устанавливают свет по Кёлеру.
Установив освещение, приступают к настройке резкости. Сначала настраивают ее с объективом малого увеличения, пользуясь макровинтом. Рабочее расстояние для таких объективов составляет обычно около 1 см. При настройке удобно ориентироваться по крупным объектам в поле зрения – пузырькам воздуха или волокнам целлюлозы.
Далее производят поворот револьвера и устанавливают объектив большого увеличения (40х). При этом важно смотреть на препарат сбоку, чтобы в случае неправильной настройки на малом увеличении не поцарапать фронтальную линзу объектива. Ошибки в настройке могут быть вызваны настройкой на нижнюю поверхность предметного стекла. Если микроскопируется препарат «раздавленная капля» этой ошибки легко избежать, ориентируясь на движение жидкости, всегда присутствующее в таких препаратах.
Следует иметь в виду, что и при правильной настройке рабочее расстояние у объективов большого увеличение очень маленькое, порядка 2-3 мм. В связи с этим, дальнейшая настройка производится только микровинтом. При необходимости заменить препарат, сначала поворачивают револьверную насадку обратно на малое увеличение, а затем производят замену препарата на новый. Из-под объектива большого увеличения препараты вытаскивать запрещается, т.к. это может привести к порче препарата и/или фронтальной линзы объектива. Не следует также поднимать тубус макровинтом для извлечения препарата, поскольку после такого действия вновь придется тратить время на настройку фокуса на малом увеличении.
В случае отсутствия у микроскопа револьверной насадки, а также при работе с иммерсионными объективами порядок работы меняется. В этом случае, поместив препарат на стекло, медленно опускают макровинтом объектив большого увеличения, глядя на препарат сбоку. Опускать объектив следует очень осторожно, почти до контакта фронтальной линзы со стеклом. Затем, глядя в окуляр макровинтом начинают медленно поднимать объектив обратно до появления изображения. Окончательную фокусировку производят микровинтом.
При работе с иммерсионной системой необходимо после окончания работы тщательно удалить все остатки масла с фронтальной линзы мягкой тряпочкой. Для эффективной очистки можно смочить тряпочку очищенным бензином. Спирт и прочие органические растворители использовать не рекомендуется, т.к. они могут разрушить крепление фронтальной линзы.
Микроскопы следует беречь от пыли, держать под чехлами или в закрывающемся шкафу. Во избежание попадания пыли в тубус не следует без необходимости вытаскивать окуляры из тубуса. В случае попадания пыли на внутренние линзы ее нужно удалять специальной кисточкой и сдувать с помощью груши. Чаще всего загрязняется глазная линза окуляра. Ее также протирают мягкой чистой тканью, при необходимости смачивая ее бензином.
Важную роль в получении четкого изображения играет и конденсор. Для получения четкого изображения на малом увеличении конденсор лучше опустить, и для контрастирования объектов прикрыть ирисовую диафрагму на 1/3. Следует помнить, что диафрагма предназначена для регулировки апертуры конденсора, а не яркости освещения. При наличии возможности, яркость света должна регулироваться отдельным резистором.
На большом увеличении апертура конденсора должна быть выше, поэтому его нужно поднять и открыть диафрагму на максимум. Закрытие диафрагмы на больших увеличениях, хотя и контрастирует объекты, но приводит к потере разрешающей способности.