Лекция № 4
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Одним из физико-химических методов количественного анализа является хроматография. Этот метод был предложен в 1930г. русским ученым М.С.Цветом. Хроматография является методом разделения сложных смесей, состоящих из близких по свойствам веществ, на составные компоненты, которые сохраняются без изменений первоначальных свойств. В основе метода лежат сорбционные процессы, происходящие при прохождении раствора веществ через колонку со слоем сорбента. Таким образом, основой хроматографического разделения является различие в сорбционной активности компонентов смеси по отношению к данному сорбенту. Под сорбцией понимают поглощение газов, паров или растворенных веществ жидкими или твердыми сорбентами. Различают 4 вида сорбции:
– абсорбция – поглощение газов, паров всем объемом твердого или жидкого сорбента;
– адсорбция – поглощение вещества поверхностью твердого или жидкого сорбента;
– хемосорбция – поглощение веществ жидким или твердым сорбентом с образованием химических соединений;
– капиллярная конденсация – образование жидкой фазы в порах и капиллярах твердого сорбента при поглощении паров веществ.
Хроматографические методы разделяются на группы в зависимости от типа сорбционного процесса.
Бумажная и тонкослойная хроматография
Она используется для количественного анализа смесей. Для этого на стартовую линию наносят в виде пятна или полосы точный объем раствора пробы известной концентрации. Затем хроматографируют и количественно определяют вещества в полученных пятнах или полосах (Рис.4.1(а)). Используют несколько способов определения компонентов пробы:
|
|
– по площади зон на хроматограмме;
– по измерению физико-химических свойств зон на хроматограмме;
– экстрагированием зоны соответствующим растворителем и анализом экстракта.
Определение по площади зон основано на явлении насыщения слоя адсорбента или бумаги веществом. Вещество распределяется на хроматограмме на площади, пропорциональной его массе. Зависимость между массой вещества q и площадью S на хроматограммах является логарифмической (Рис.4.1(б)):
,
где a и b - коэффициенты.
|
| Рис.4.1. Зависимость площади пятен на хроматограмме от количества вещества а – хроматограмма; б – калибровочный график |
Эта зависимость линейна для количеств вещества от 1 до 80–100 мкг. Кроме площади используют измерение ширины и длины пятна, произведение которых пропорционально логарифму количества вещества в пятне.
Во избежание ошибок применяют стандартные растворы, их наносят на хроматограмму, стремясь получить серию пятен с различным содержанием стандарта. На эту же хроматограмму наносят определенный объем пробы. Хроматографируют, подсушивают, обрабатывают раствором реактива, подсушивают, измеряют площадь зон планиметром или с помощью миллиметровой бумаги. Строят калибровочный график зависимости площади зон от массы стандарта и по графику определяют массу компонента в растворе пробы. Ошибка метода составляет 5–10 %.
Более точен денситометрический метод. В нем проводят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом на десинтометре. На нем получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Построив с помощью стандартов калибровочный график, измеряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе.
|
|
При применении способа экстрагирования компонентов на хроматограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. Производят обработку хроматограммы, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и экстрагируют его растворителем. Полученный раствор анализируют инструментальным методом, имеющим высокую чувствительность.
Бумажная и тонкослойная количественная хроматография обладает высокой чувствительностью. Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью 5–7%.
4.2. Газовая хроматография
В этом методе происходит распределение компонентов анализируемой смеси между газообразной и твердой или жидкой фазами. В установке для газовой хроматографии используют твердый инертный пористый носитель; эта жидкая или твердая фаза неподвижна. Подвижной фазой является газ-носитель, в котором содержится анализируемая проба. В качестве газа-носителя применяют инертные газы, не взаимодействующие с парами веществ – азот, диоксид углерода, гелий, аргон, водород.
При проведении анализа в нагретый до определенной температуры поток газа-носителя вводят пробу, вещества которой испаряются и вместе с потоком газа поступают в термостатированную колонку с неподвижной фазой (адсорбентом). На выходе из колонки смесь разделяется на индивидуальные вещества, поступающие с потоком газа на детектор. Схема газового хроматографа приведена на рис.4.2.
|
|
Детектор – наиболее ответственный узел газового хроматографа. Он реагирует на изменение состава газа при его выходе и передает эти данные регистрирующему прибору. Детекторы бывают интегральные и дифференциальные. Сигнал интегрального детектора пропорционален общей массе вещества в потоке газа. При прохождении через детектор чистого газа-носителя на ленте записывается горизонтальная линия; когда через детектор проходит компонент смеси, перо самописца перемещается, вычерчивая ступени, высота которых пропорциональна массе компонента. Работа дифференциальных детекторов основана на:
а) различии в теплопроводности определяемых компонентов и подвижной фазы – катарометры;
б) изменении электрической проводимости при ионизации компонентов анализируемой смеси – ионизационные детекторы;
в) разности плотности газа и пробы – денситометрические детекторы;
г) на измерении поглощения в монохроматическом свете – спектрофотометрические детекторы.
|
| Рис.4.2. Схема газового хроматографа 1 – источник газа; 2 – регулятор потока газа; 3 – дозирующее устройство; 4 – термостатированная колонка; 5 – детектор; 6 – самописец; 7 – блок нагрева колонки |
Для измерения и записи импульсов с детектора применяют милливольтметры и потенциометры. Регистрируя сигнал, получают график – хроматограмму.
4.3. Капиллярная хроматография
Это разновидность газовой хроматографии. В качестве хроматографирующей колонки используют капилляры диаметром 0,05–1 мм и длиной до 1000 м. Они выполняют функцию твердого носителя, стенки их покрыты жидкой или твердой фазой. Большая длина и малый диаметр обеспечивают высокую эффективность разделения смесей веществ, большую скорость разделения и высокую чувствительность.
Основными проблемами капиллярной хроматографии являются: изготовление тонких капилляров большой длины, нанесение на стенки капилляров тонкого слоя жидкой или твердой фазы. Капилляры делают из меди, алюминия, стекла, пластика и др. Неподвижную фазу растворяют в летучем растворителе и пропускают небольшое количество раствора (пробу) через колонку, используя давление газа. Раствор смачивает стенки капилляра, которые после удаления растворителя током азота покрывают тонким слоем неподвижной жидкой фазы, в качестве которой применяют высококипящие углеводороды – сквалан, октадецен, вазелиновое масло и др.
Детектирующие системы в капиллярной хроматографии должны иметь высокую чувствительность (до 10–10 г), маленький объем рабочей камеры (10–20 мм 3) и срабатывать очень быстро (0,1–0,01 с).
Чаще всего применяют детекторы пламенно-ионизационного и ионизационного типа. Для регистрации сигнала детектора используют скоростные самописцы или осциллографы. Ввод проб в хроматограф осуществляется микродозаторами шприцевого типа объемом 1–2 мм 3.
Капиллярная хроматография обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью, например, за несколько минут можно разделить и количественно определить смесь изомерных углеводородов из 15–20 соединений.
Важнейшим достоинством капиллярного хроматографа является малый объем газа, необходимый для осуществления процесса. Это позволило успешно применить для детектирования разделенных веществ масс спектрометры. Разработаны совмещенные анализаторы типа газовый хроматограф – масс-спектрометр (Рис.4.3). В этих приборах газовый поток из хроматографа вводится в специальный сепаратор, где с помощью вакуумирования удаляется газ-носитель, а тяжелые молекулы веществ поступают в камеру, ионизируются и подвергаются масс-спектрометрическому определению. Подобные приборы объединяют с быстродействующей электронно-вычислительной машиной, которая производит расчет количества, определение типа вещества и автоматическую выдачу полученных данных в виде бланка с напечатанными результатами.
|
| Рис.4.3. Схема хромато масс-спектрометра 1 – баллон с газом; 2 – ввод пробы; 3 – хроматографическая колонка; 4 – форкамера; 5 – масс-спектрометр; 6 – самописец |
4.4. Жидкостная хроматография
Жидкостная хроматография основана на тех же принципах, что и газовая, с той лишь разницей, что вместо газа носителя используется поток жидкости, не смешивающийся с неподвижной фазой, находящейся в колонке. При вводе пробы анализируемого материала в поток жидкого носителя в хроматографической колонке происходят процессы перераспределения веществ между подвижной и неподвижной фазами и смесь разделяется на индивидуальные соединения. На детекторе регистрируются пики, соответствующие индивидуальным веществам. Жидкостная хроматография позволяет анализировать практически любые смеси веществ, растворимые в том или ином растворителе.
Приборы для жидкостной хроматографии имеют ряд конструктивных особенностей. Жидкий носитель должен подаваться в хроматограф под определенным давлением вследствие того, что хроматографическая колонка обладает высоким сопротивлением потоку. Поэтому его подают с помощью поршневых насосов или мембранных устройств, работающих под давлением газа. Мембрана, разделяющая газ и жидкую фазу, нужна для предупреждения растворения газа. Для введения пробы применяют двухканальные краны или микрошприц. Колонки имеют небольшой диаметр (2–6 мм), длина колонок достигает 1 м. Их изготавливают из стекла, нержавеющей стали, тефлона. В качестве адсорбентов в жидкость–твердой хроматографии используют оксид алюминия, силикагель, активированный уголь, капрон, кизельгур и др.
В жидкость–жидкостной хроматографии носители жидкой фазы аналогичны носителям газовой хроматографии, неподвижная фаза не должна смешиваться с подвижной, ее наносят в виде раствора в летучем растворителе, удаляя последний током азота, либо смачивают ею носитель, которым набивают колонку. Подвижную фазу вводят в колонку и пропускают через нее для устранения неоднородности слоя носителя.
Детекторы жидкостной хроматографии имеют свои особенности. Для детектирования используют преломление светового луча, оптическое поглощение, электрохимические свойства раствора вещества в подвижной фазе, либо применяют химическое детектирование, проводя фотометрическую реакцию с веществом, либо испаряют жидкую фазу, и полученный поток паров детектируют методами, принятыми в газовой хроматографии. Наибольшее распространение получили рефрактометрические (чувствительность до 1·10–4 единиц показателя преломления), спектрофотометрические (чувствительность 1·10–2 единицы поглощения), адсорбционно-термометрические, использующие измерение теплоты адсорбции вещества (чувствительность 1·10–5 моль). Сигнал детектора регистрируется далее самописцем. Кроме указанных типов детекторов применяют коллекторы фракций и полученные жидкие фракции анализируют подходящим методом.
Жидкостная хроматография – универсальный метод химического анализа, он обладает высокой чувствительностью, избирательностью и универсальностью. Важной особенностью метода (в отличие от газовой хроматографии) является возможность проведения процесса при комнатной температуре, что ценно при исследовании белков, аминокислот и других неустойчивых соединений.