Редуктазная проба с резазурином

Лабораторная работа

Микробиологическое исследование молока – проба на редуктазу. Определение антибиотиков в молоке

Цель работы: Ознакомиться с методиками определения свежести молока пробой на редуктазу с метиленовым голубым и с резазурином, и антибиотиков в молоке. Приобретение навыков микробиологического исследования молока.

Задание

1. Определить свежесть молока пробой на редуктазу с метиленовым голубым и с резазурином.

2. Определить антибиотики в молоке.

Оборудование и реактивы:

Проба молока (свежее и пастеризованное), пробирки с пробкой, раствор резазурина, раствор метиленового синего, водяная баня или термостат, термофильный стрептококк.

Методические указания

Молоко, представляющее собой один из наиболее полноценных продук­тов питания, в то же время является хорошей питательной средой для развития и размножения микроорганизмов. Основными источниками попадания микро­бов в молоко являются вымя и кожный покров животного, руки доильщика, по­суда, воздух и др.

В процессе хранения молока микроорганизмы изменяют его свойства. Для более длительного сохранения первоначальных свойств молока необходи­мо снижать до минимума возможности попадания в него микроорганизмов в процессе хранения и транспортирования.

При исследовании необходимо обращать внимание на количественный состав микрофлоры молока. Это дает возможность правильно вести борьбу с возбудителями порчи молока.

В молоко при нарушении санитарных требований могут попасть бактерии
кишечной группы, маслянокислые, гнилостные (аэробы, анаэробы), дрожжи и
плесневые грибы, которые вызывают различные пороки молока и молочных
продуктов.

Бактерии, попадающие в молоко, в результате жизнедеятельности выделяют ферменты, в частности редуктазу. В только что выдоенном молоке редуктаза отсутствует. Поэтому об общей бактериальной обсемененности молока можно судить по наличию данного фермента.

При нарушении санитарно-гигиенических правил получения и хранения молока количество бактерий в нем возрастает, а следовательно, увеличивается и количество фермента. Редуктаза способна обесцвечивать добавленные к молоку слабые органические красители – раствор метиленовый голубой (метиленовая синь) или резазурин. Обесцвечивание окраски происходит тем быстрее, чем больше в молоке редуктазы, а значит и бактерий. Поэтому по редуктазной пробе судят о санитарных условиях получения молока и о его свежести.

Отбор проб молока

Для бактериологического исследования молоко отбирают в стерильную колбу после тщательного перемешивания в количестве 50 мл. Измеряют темпе­ратуру продукта и охлаждают до 6 °С. Микробиологическое исследование проводят тот час же или не позднее 4 часов с момента отбора проб.

Проба на редуктазу

Для определения бактериальной чистоты и свежести молока проводят пробу на редуктазу, основанную на способности бактерий выделять редуктазу, восстанавливающую краски (метиленовый синий, резазурин). Обесцвечивание метиленового синего и резазурина наступает тем быстрее, чем больше микро­бов в молоке. По скорости обесцвечивания краски молоко разделяют на 4 клас­са (таблица 1).

Таблица 1

Постановка пробы

В пробирки наливают 20 мл молока и 1 мл раствора метиленового синего или 10 мл молока и 0,5 мл раствора метиленового синего. После тщательного смешивания пробирки помещают в водяную баню или термостат при температуре 38-40 °С. Такую температуру поддерживают в течение всего опыта до полного обесцвечивания молока. Первые 20 мин наблюдения ведут непрерывно, в дальнейшем просмотр пробирок производят периодически через каждые 15-30 мин.

Обесцвечивание молока может произойти и через 2 часа, и через 5,5 часов после начала анализа. Окончанием опыта считать момент обесцвечивания окраски молока. В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из классов.

Приготовление раствора метиленового синего

5 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего прибавляют к 195 мл дистиллированной воды. Смесь хорошо перемешивают. Срок хранения полученного раствора не более 7 суток.

Метод широко используется ввиду простого выполнения и быстрого по­
лучения результатов.

Редуктазная проба с резазурином

В стерильные пробирки вносят по 1 мл рабочего раствора резазурина и по
10 мл исследуемого молока, закрывают корковыми пробками, смешивают путем
трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в водяную баню
с температурой воды 38°С и защищают от действия прямых солнечных лучей.
Время погружения пробирок в водяную баню считают началом анализа. Показания снимают через 20 минут и через 1 час, не встряхивая и не переворачивая пробирки. Через 20 минут пробирки с обесцвеченным молоком удаляют из во­дяной бани. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхива­нии не учитывается. Оставшиеся пробирки однократно переворачивают и ос­тавляют в бане до конца анализа. В зависимости от времени обесцвечивания и изменения окраски молоко относят к одному из четырех классов: