Холодильник.
Используется для хранения культур микроорганизмов, иммунобиологических препаратов.
Центрифуга.
Используется для разделения жидкостей с различной плотностью, для получения сыворотки крови, для разделения твердых тел от жидкостей.
Сушильный шкаф.
Имеет несколько температурных режимов. Применяется для сушки лабораторной посуды.
Бактериоскопический метод состоит в. изучении микроорганизмов под микроскопом. Исследованию могут подвергаться как микроорганизмы в живом состоянии, так и убитые окрашенные микробные клетки.
Методические указания:
Приготовление препаратов для микроскопического исследования.
Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой.
Петлю прокаливают в пламени спиртовки. Вращательным движением вынимают из пробирки пробку и обжигают край пробирки. Вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, захватывают материал. После приготовления препарата петлю прожигают в пламени спиртовки.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков.
1.Для приготовления препарата подготавливают предметное стекло, обезжиривая его.
2.На обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла.
3.Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки.
4.Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом (спиртами, смесью Никифорова и т.д.).
Этапы приготовления фиксированного мазка:
1.Подготовка предметного стекла
2.Приготовление мазка
3.Высушивание микропрепарата
4.Фиксация микропрепарата
Окраска препарата простым способом.
1.Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему остыть.
2.Наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин.
3.Смывают краситель водой.
4. Высушивают препарат фильтровальной бумагой.
Морфология бактерий – размер, форма и взаимное расположение бактериальных клеток
Схема описания морфологии бактерий в мазке:
1. Форма
2. Размеры
3. Характер концов (для палочек)
4. Взаиморасположение
Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения микроорганизмов.
Метод «висячей» капли.
1. На покровное стекло наносят каплю исследуемого материала.
2. Предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так. Чтобы капля находилась в центре лунки.
3. Переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В готовом препарате капля должна висеть над лункой, не касаясь ее дна.
Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения, находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив и исследуют препарат, определяя подвижность микроорганизмов.
Метод «раздавленной» капли.
На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и покрывают ее покровным стеклом. Капля не должна выходить за пределы покровного стекла. Раздавленную или висячую каплю, микроскопируют с помощью с иммерсионной системы в затемненном поле зрения — при суженной диафрагме и опущенном конденсоре.
Рекомендуется их микроскопировать в микроскопе с темным полем зрения.
Контрольные вопросы:
1. Что изучает медицинская микробиология?
2. Какие виды лабораторий существуют?
3. Назовите основные виды микроскопов, используемых для работы различных лабораторий.
4. Что такое морфология бактерий?
5. Назовите основные морфологические формы бактерий.
6. Почему разрешающая способность иммерсионного объектива выше, чем сухого?
7. Назовите этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии.
8. Для чего необходима фиксация мазка?
9. Какова последовательность простой окраски препарата микроорганизмов?
Д. З. Заполнить таблицу:
Отличительные черты прокариот от эукариот
| признак | Прокариоты | эукариоты | ||
| Мезосомы | ||||
| Анаэробный процесс | ||||
| Фиксация азота | ||||
| Мембранные структуры | ||||
| Органеллы движения | ||||
| Генетический материал | ||||
| Расположение | ||||
| Форма | ||||
| Внехромосомная ДНК | ||||
| Гистоны | ||||
| Тип деления | ||||
| Синтез белка | ||||
| рибосомы | ||||
| Место синтеза | ||||
| Клеточная стенка | ||||
| Структурные элементы | ||||
| Стеролы | ||||
Список литературы:
Обязательная:
1.Борисов Л.Б,, Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.
2.Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.
3.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
4.Коротяев А.И., Бабичев С.А. СпецЛит. 2000 г.
Дополнительная:
1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.
2. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., 1982 г.
Занятие № 2 Морфология бактерий. Тинкториальные свойства бактерий. Окраска по методу Грама.
Цель: Научиться окрашивать мазки по методу Грама и изучать морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов
Знать: Особенности морфологии бактериальных клеток. Методику окрашивания по методу Грама.
Уметь: Приготовить мазок, окрасить его, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.
Обоснование темы: Морфология бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний
Вопросы для самоподготовки:
1. Основные морфологические группы бактерий.
2. Особенности морфологии грибов, актиномицетов, риккетсий, спирохет, микоплазм и хламидий.
3. Понятие о простых и сложных методах окраски.
4. Выявление различий в строении клеточной стенки бактерий с помощью окраски по Граму.
ПЛАН
Программа:
1. Морфология бактериальных клеток.
2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама
3. Основные отличительные черты простых и сложных методов окрашивания.
Демонстрация:
1. Мазок из смеси бактерий (окраска по методу Грама)
2. Мазки различных морфологических форм микроорганизмов.
Задание студентам:
1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате из смеси бактерий (окраска по методу Грама). Зарисовать.
2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.
3. Микроскопировать и зарисовать мазки различных морфологических форм бактерий. Заполнить таблицу:
Основные морфологические формы бактерий
| Кокки | Палочки | Извитые | Нитчатые |
Информационный материал.
Морфологические формы бактерий
Известны четыре основные формы бактерий: шарообразная, палочковидная и извитая и нитевидная. В соответствии с этим все бактерии по форме подразделяются на следующие группы:
1) кокки (шарообразные),
2) бактерии (палочковидные),
3) спириллы (извитые в виде спирали)
4) актиномицеты (нитевидные)
1. Кокки — бактерии круглой формы, имеющие в диаметре 1—2 мкм. Они различаются между собой по взаимному расположению отдельных клеток, которое зависит от способа их деления. Если по окончании деления кокки разъединяются на отдельные шарики, получается форма микрококка. Группа из двух кокков носит название диплококка. Если деление кокков происходит в одном направлении и образующиеся кокки не разъединяются, то получается цепочка из шариков. Эта форма носит название стрептококка.При делении в двух взаимно перпендикулярных направлениях возникают сочетания по четыре кокка — тетракокка.
Если деление происходит в трех взаимно перпендикулярных направлениях, кокки соединяются в виде объемных пакетов и получают название сарцин.
Если кокки образуют скопления клеток в виде виноградных гроздьев, они называются стафилококками.
Кроме того, кокки могут иметь правильную круглую форму, овальную форму, ланцетовидную форму, бобовидную форму.
2. Бактерии – имеют палочковидную форму размером от нескольких долей микрона до 1—5 мкм (различают короткие, длинные, тонкие и толстые палочки). Они различаются друг от друга наличием споры, ее диаметром, формой концов и т.д. Бациллами называют палочки, которые способны образовывать споры, не превышающие в диаметре клетку. Клостридиями считают бактерии, способные к образованию спор, значительно превышающих диаметр бактериальной клетки. Палочки, не способные к спорообразованию, называются бактериями (в узком смысле этого слова).
Бывают палочки с закругленными концами, например, кишечная палочка, с обрезанными краями (палочка сибирской язвы); с заостренными краями (фузобактерии). У коринобактерий края палочек утолщены из-за наличия в них запасов валютина.
Палочки могут располагаются одиночно, по две бактерии (диплобациллы), в виде цепочек (стрептобациллы); некоторые палочки располагаются под углом (коринобактерии дифтерии).
3. Извитые формы. Если бактерия имеет один завиток спирали, она называется вибрионом (холерный вибрион). Длина вибрионов 1—3 мкм. Кампилобактерии имеют изгибы тела, напоминающие крылья летящей чайки.
Спириллы, спиралевидные, неподвижные микроорганизмы, имеющие более одного завитка, длиной от 5 до 30 мкм.
Спирохеты - подвижные, извитые формы микроорганизмов. Различают следующие разновидности спирохет: трепонемы имеют 8-12 завитков, симметричны; боррелии имеют 3-8 крупных завитка, не симметричны и лептоспиры, симметричные микроорганизмы имеющие более 10 мелких завитков и 2 крупных изгиба на концах клетки, напоминающие букву S или C.
Методические указания:
Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.
Окраска по методу Грама:
1. На фиксированный мазок нанести основной краситель – генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.
2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.
4. Промыть водой.
5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.
6. Промыть водой, высушить.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя. Тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.
Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным – гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.
Для правильной окраски следует соблюдать технику окрашивания.
Контрольные вопросы:
1.Назовите основные морфологические формы бактерий.
2 Каково строение клеточной стенки бактериальной клетки?
3.Каковы основные отличительные признаки Гр(-) и Гр(+) микроорганизмов?
4. Каково значение сложных методов окрашивания при диагностике инфекционных заболеваний?
5. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Грама.
Д.З. Заполнить таблицу
Структура бактериальной клетки
| органоид | Функция | Методы выявления |
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
Занятие № 3 Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски.
Цель: Изучить строение бактериальной клетки, функции и методы выявления отдельных органоидов. Научиться окрашивать мазки по методу Циля-Нильсена, Бурри и Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешко.
Знать: Особенности морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток.
Уметь: Приготовить мазок, окрасить его сложным методом, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.
Обоснование темы: Строение бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний
Вопросы для самоподготовки:
1. Отличительные черты клеток прокариотов от клеток эукариотов.
2. Облигатные компоненты клеток прокариотов
3. Факультативные компоненты клеток прокариотов.
4. Методы изучения структуры бактериальных клеток и их практическое значение.
5. Бактериоскопический метод диагностики. Его достоинства и недостатки.
ПЛАН
Программа:
1. Ультраструктура бактериальных клеток
2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама
3. Сложные методы окраски (методы Ожешко, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Нейссера)
Демонстрация:
1. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри-Гинса)
2. Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза в мокроте (окраска по методу Циля-Нильсена)
3. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Ожешки)
4. Зерна волютина у коринебактерий дифтерии (окраска по методу Нейссера)
Задание студентам:
1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате (окраска по методу Грама). Зарисовать.
2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическм признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.
4. Микроскопировать и зарисовать:
- капсулы клебсиелл (окраска по методу Бурри и Бурри-Гинса)
- коринебактерии дифтерии, содержащие зерна валютина (окраска по методу Нейссера)
- кислотоустойчивые микобактерии (окраска по методу Циля-Нильсена)
- споры бацилл сибирской язвы (окраска по методу Ожешки)
Информационный материал.
Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.
В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула, жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.
Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:
1. Отсутствие ядерной оболочки
2. Отсутствие ядрышка
3. Отсутствие гистонов
Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или по Романовскому-Гимза.
Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициент седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания. Например, в цитоплазме у С. diphtheriae присутствуют зерна волютина, они являются включениями фосфатов и имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию. Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.
Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, участвует в процессах обмена веществ и деления клетки.
У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.
Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.
Цитоплазматическая мембрана участвует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта веществ. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.
Капсула расположена снаружи клеточной стенки, представляет собой слизистое образование, состоящее из полисахаридов или полипептидов. Она имеет защитное значение, у патогенных бактерий капсула образуется чаще всего внутри организма человека или животного и препятствует фагоцитозу, повышает устойчивость к действию антител.
Некоторые бактерии (например, клебсиеллы, псевдомонады) образуют капсулу и в организме больного, и на питательной среде, где они дают крупные, слизистые колонии.
Капсула выявляется при специальных методах окраски.
Споры образуются при неблагоприятных условиях внешней среды (Вас. аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению вида и не является способом размножения. У клостридий спора превышает диаметр клетки, у бацилл – нет. Форма спор может быть овальной или округлой. У С. Tetani споры расположены терминально, для Вас. Аnthracis характерно центральное расположение спор. Споры химически инертны, поэтому окрашиваются с трудом. Для выявления этих структур используют окраску по методу Ожешки.
Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пучком жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у которых жгутики расположены вокруг тела.
Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по методу Леффлера, серебрения по Морозову.
Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования, расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка пилина. Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются друг от друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой обмен. Пили участвуют в процессе конъюгации и образуются мужскими клетками-донорами.
Бактериоскопический метод диагностики основан на выявлении возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемом материале по морфологическим, тинкториальным свойствам по взаимному расположению с применением различных методов окраски или в нативном состоянии.
Сфера применения: метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическим, тинкториальными, свойствами и типичной локализацией в организме, Например: гонорея, сифилис, возвратный тиф, туберкулез, некоторых микозы.
К достоинствам метода относятся быстрота, доступность, экономичность. К недостаткам метода относятся недостаточная информативность, низкая чувствительность, невозможность дифференциации внутри вида.
Методические указания:
Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.
Окраска зерен волютина по методу Нейссера:
1. На фиксированный мазок нанести уксуснокислый метиленовый синий Нейссера на 2-3 мин.
2. Промыть водой.
3. Нанести дополнительный краситель - везувин.
4. Промыть водой, высушить.
При окраске образуется нерастворимый в воде комплекс: краситель-валютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы валютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем окрашивается везувином в желтый цвет.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:
1. На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.
2. Промыть водой.
3. Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть водой.
5. Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.
6. Промыть водой, высушить.
В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.
Окраска капсул по методу Бурри-Гинса:
1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла сделать мазок.
2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.
3. Промыть водой, высушить.
Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и остаются прозрачными на темном фоне туши.
Окраска спор по методу Ожешко:
1. Протравливание мазка 0,5 % раствором соляной кислоты 2-3 мин при нагревании.
2. Промыть водой.
3. Окрасить по методу Циля-Нильсена.
Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. В результате окрашивания споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.
Контрольные вопросы:
1. Какое строение и функции имеет нуклеоид бактериальной клетки?
2. Какое значение в жизни бактерий имеют плазмиды?
3. Каково строение спор бактерий?
4. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Циля-Нильсена, Бурри, Ожешки, Нейссера.
5. С помощью какого метода окраски возможно обнаружить капсулы у бактерий?
Список литературы:
Обязательная:
1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.
2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.
3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г
4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.
Дополнительная:
1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.
2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.
3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.
Занятие № 4 Физиология микроорганизмов.Бактериологический метод диагностики.питание бактерий. Питательные среды. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
Цель: Научиться выделять чистую культуру микроорганизмов, учитывать рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных заболеваний, особенности и классификацию питательных сред, особенности питания бактерий.
Уметь: Описывать культуральные свойства микроорганизмов, выделять чистые культуры с помощью механических методов.
Обоснование темы: Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний, для его постановки необходимы сведения о основных питательных потребностях бактерий и условиях их культивирования.
Вопросы для самоподготовки:
1. Особенности бактериологического метода диагностики, его достоинства и недостатки.
2. Питание бактерий. Потребности в питательных веществах.
3.Требования, предъявляемые к питательным средам.
4. Классификация питательных сред.
5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
ПЛАН
Программа:
1. Метаболизм аэробных и анаэробных бактерий.
2. Питательные среды, применяемые для культивирования.
3. Понятие о чистой культуре и методы ее выделения.
Демонстрация:
1. Готовые питательные среды: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, среда Эндо, желточно-солевой агар, солевой бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева.
2. Техника посева исследуемого материала петлей и шпателем на чашку Петри с плотной питательной средой с целью получения изолированных колоний.
Задание студентам:
1.Ознакомиться с питательными средами, их назначением: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среда Эндо, среда Плоскирева, желточно-солевой агар ЖСА, солевой бульон (СА) селенитовый бульон и основными инградиентами для их изготовления.
2. Описать характер роста микроорганизмов на плотной питательной среде, оценить культуральные свойства бактерий
3.Описать характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах.
4. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала и наметить ход дальнейшего исследования. Осуществить посев инокулята по методу Дригальского. Осуществить посев инокулята истощающим штрихом.
6. Заполнить таблицу. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.
Информационный материал.
Основные среды:
Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде, состоит из триптического гидролизата кильки хлорида натрия.
Питательный агар. Состав: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, агар, хлорид натрия.
Элективные питательные среды.
Желточно-солевой агар. Содержит 8-10% хлорида натрия, который не препятствует росту стафилококков и питательную основу с лецитином, при расщеплении которого вокруг колоний образуется перламутровый венчик преципитата.
Дифферинциально-диагностические среды.
Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.
Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.
Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.
Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.
Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.
Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.
Состав: МПА - питательная основа; 10% NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.
Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.
Требования к питательным средам:
1. Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли, факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов.
2. Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl.
3. Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры
4. Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.
5. Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих.
6. Среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур.
7. Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.
Культуральные свойства микроорганизмов – особенности роста микроорганизмов на плотной питательной среде.
Бактериологический метод – основной метод диагностики инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию(посев на плотные питательные среды, на жидкие питательные среды, определение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества микроорганизмов в исследуемом материале – определение вида и штамма микроорганизма.)
Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.
Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основных группы методов выделения чистых культур:
1. Методы, основанные на механическом разделении.
2. Методы, основанные на различиях в биологических свойствах.
Чаще всего используют механические способы разъединения бактериальных клеток - специальные методы посева.
Техника посева материала на плотную питательную среду.
Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического распределения микробов при посеве. Существует несколько способов посева материала.
Посев по методу Дригальского производится шпателем в чашку Петри на плотную питательную среду. Предварительно в центр среды петлей вносят каплю исследуемой культуры, а затем растирают по всей поверхности с помощью стерильного шпателя.
Посев истощающим штрихом производят петлей, предварительно разделив чашку Пери на 4 равных квадрата. Посев начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.
Получение сливного роста можно использовать для накопления полученной культуры. В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с материалом и производят посев зигзагом, двигаясь снизу вверх.
Ко второй группе методов получения чистых культур микроорганизмов относятся:
а) фильтрация. Исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (например, для очистки вирусов от бактерий)
Биологические методы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.
а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, при этом подвижные формы микроорганизмов при размножении «выползают» на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris).Отсевая верхний край культуры в воду свежескошенного агара и повторяя эту манипуляцию несколько раз, можно получить чистую культуру.
б) метод прогревания – прогревают материал до 800С на водяной бане 10-15 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на питательную среду прорастают (метод позволяет отделить споровые культуры от неспоровых)
в) метод охлаждения – выращивание микроорганизмов при низких температурах. Применяют для выделения чистых культур психрофильных бактерий (микроорганизмы рода Yersinia выращивают при температуре 50 С)
г) бактериостатический метод при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на других (пенициллин задерживает рост Гр+ микроорганизмов, не влияя на ГР-, 5% Н2SO4 убивает большинство микроорганизмов, исключая кислотоустойчивых (возбудитель туберкулеза)
д) метод обогащения посев на элективные среды
е) заражение лабораторных животных.
Методические указания:
Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:
1.Форма колонии
2.Размер колонии
3.Цвет
4.Характер края
5.Характер поверхности
6. Консистенция
Посев по методу Дригальского.
1.Подготовить 3 чашки Петри со стерильной питательной средой.
2. В центр среды петлей вносят 1 каплю исследуемой культуры.
3. Равномерно растирают каплю шпателем по поверхности питательной среды в чашк