Стерилизация питательных сред.

Автоклавирование. Питательные среды стерилизуют главным образом в автоклавах насыщенным паром под давлением 0,05-0,2 МПа. Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация). Данный способ применяют для стерилизации питательных сред, изменяющих свой состав и свойства под действием температур выше 100 ºC. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды (или ее компонентов) проводят при 100 ºC три раза по 30 мин трое суток подряд. Кратковременное прогревание среды кипячением уничтожает в основном термолабильные вегетативные клетки микроорганизмов. Поэтому между нагреваниями питательные среды выдерживают при комнатной температуре (или в термостате при 30 ºC) и дают возможность прорасти оставшимся жизнеспособным спорам. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные клетки погибают при повторном кипячении. Продолжительность нагревания может быть увеличена до 45-60 мин, что зависит от объема жидкости. Стерилизация путем прерывистого нагрева была предложена английским физиком Джоном Тиндалем и получила название тиндализации. Среды необратимо изменяющиеся при кипячении, осторожно прогревают при более низкой температуре: при 60-80 ºC в течение 5 сут подряд по 30-60 мин или при 56-58 ºC на протяжении 6-7 сут, в первые сутки – 2 ч, в последующие – по 1 ч. Температурную обработку сред ведут на водяной бане или в ультратермостате, где температура автоматически поддерживается на определенном уровне с помощью специального устройства. В промежутках между нагревами среды выдерживают в обычном термостате при 30 ºC. Пастеризация. Пастеризация, или неполная стерилизация, предложена Луи Пастером. Она предназначена для уничтожения в основном аспорогенных микроорганизмов однократным прогреванием при температуре 60-75 ºC и выдержке 15-30 мин или при 80 ºC в течение 10-15 мин. Пастеризации подвергаются продукты и среды, которые при воздействии боле высоких температур претерпевают глубокие изменения, теряют качество и питательную ценность. Пастеризацию широко применяют в пищевой промышленности. Стерилизация фильтрованием. Стерилизацию жидких питательных сред, не выдерживающих даже незначительного нагревания, производят фильтрованием через специальные мелкопористые бактериальные фильтры. На бактериальных фильтрах задерживаются механические взвешенные примеси, в том числе и клетки микроорганизмов. Исключение составляют вирусы и фаги. Фильтрованию подвергают среды с белками, антибиотиками, витаминами, летучими веществами, а также культуральные жидкости с целью освобождения от клеток и сохранения всех продуктов метаболизма в неизменном виде. Фильтры изготавливают из положительно заряженных материалов.

16 Иммобилизация лекарственных средств. Иммобилизация - это повышение стабильности вещества. Она позволяет пролонгировать терапевтич действие, усилить эффект, уменьшить дозу и частоту введения ЛС. Она имеет свои особенности. Очень важен правильный выбор носителя, к которому выдвигается ряд требований: 1)носитель д. обладать устойчивостью к воздействию м/о; 2)дБ нетоксичным 3)д. иметь известный механизм распада в организме; 4) д.б изучены пути выведения носителя или его продуктов распада из организма; 5) д.б изучены побочное воздействие на организм. В качестве носителей исп-т сополимеры акриловых кислот, гепарины, ионообменные смолы. Выбор носителя и способа иммоб-ии д.подбираться с учетом способа введения ЛП. Чаще всего исп-т синтетические полимеры, которые д.иметь строго опред молекулярную массу. Полимеры не д.содержать остаточных мономеров, д. обладать однородностью. Полимеры носителей м. и сами обладать опред физиологич активностью. Например: поливинилпиридин и поливинол обл-т детоксикац действием. Иммобилизация ЛС способна изм-ть их свойства, особенно если эти вещества сложные белки. Увелич-ся их устойчивость к температурным изменениям, действию м/о.

18. Механизмы регуляции биосинтеза первичных и вторичных метаболитов, управление процессами. Общий компонент клеточной оболочки, присущим клеткам м/о,растений и жив-х, явл-ся цитоплазматическая мембрана-двухслойная фосфолипидная субклеточная структура с включенными в нее разнообразными по функциям белками.Системы регуляции транспорта из среды в клетку необходимых клетке вещ-в и системы выброса ненужных вещ-в из клетки в среду обяз-но связаны с цитоплазматической мембраной.Процессы транспорта ч/клеточную оболочку подразделяют на пассивную диффузию, облегченную диффузию и активный транспорт.При пассивной диффузии,в соответствии с градиенто концентрации,когда в среде концентрация выше,чем внутри клетки,в клетку проникает вода,УВ,молекулы O₂,N,H₂. При облегч-ой диффузии необходимые клетке в-ва переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз-особого класса белков,содер-ся в мембране.Переносимое в-во реагирует с пермеазой на наружной стороне мембраны и освобождается после переноса через мембрану внутри клетки.В-во продвигается по градиенту концентрации,затрат энергии не требуется.При активном транспорте в-во в клетку,требующем затраты энергии, движение переносимого в-ва происходит против градиента концентрации.Если энергодающие р-ции блокируются реагирующим с функционал-ми группами белковой части ферментов, то активный транспорт в клетку низкомолекул-х в-в прекращается. Источником энергии д/активного транспорта явл-ся трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода.Переносчики,имеющие места связывания протонов и молекул субстрата, используют мембранный потенциал д/переноса внутрь клетки ионов водорода и пит-х в-в.Переносчик, связавшись с протоном,повышает свое сродство к субстрату. Освободившись от протона на поверхности мембраны, обращенной внутрь клетки, переносчик снижает сродство к субстрату.Такой транспотр называется «симпорт».Если переносчик осущ-т перенос только одного субстрата- наз-ся «унипорт».механизм транспорта одним и тем же переносчиком двух субстратов именуется «антипорт». АТФ-зависимые системы активного транспорта используют энергию АТФ.Самостоят-ый интерес представляет выведение из клети избыточных продуктов метаболизма, защитных ферментов, АБ и экзоферментов,позволяющих утилизировать находящиеся в среде полимеры.Низкомолек-ые в-ва выводятся путем пассивной или облегченной дифф-и.Сущ-ют и энергозависимые системы..Особый интерес вызывает проблема выведения из клетки белка,синтезируемого в цитоплазме,включая чужеродный белок,являющ-ся целевым продуктом.

20. Единая система GMPпри внедрении в практику ЛП. GMP – это единая система требований по контролю качества лекарственных средств с начала переработки сырья до производства готовых препаратов, включая общие требования к помещениям, оборудованию и персоналу. С 1975 г. правила GMP расширены, и они касаются различных химических и биологических веществ в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых в животноводстве; исходных материалов для использования в дозированных формах, если они включены в законодательства стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации о безопасности и эффективности перечисленных веществ, материалов и препаратов. Правила GMP включает три части:1) "Управление качеством в промышленном производстве лекарственных средств: философия и основные составляющие";2) "Практика качественного производства и контроль качества";3) "Дополнительные и вспомогательные направления". Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заключения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления необходимой документации и др. Вторая часть содержит два раздела – производство и контроль качества. Применительно к производству лекарственных средств указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения методов ведения технологического процесса согласно нормативно-технической документации с целью получения продукта требуемого качества и в соответствии с разрешением на его изготовление и продажу. По возможности избегать любых отклонений от методик или инструкций. При наличии таких отклонений необходимо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначен­ного ответственного лица, а при необходимости – привлечение службы отдела контроля качества.Операции с различными продуктами не должны выполняться, одновременно и последовательно в одном и том же помещении пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загрязнения. Доступ в производственные помещения должен быть ограничен лишь определенным кругом лиц, занятым в производстве. Избегать изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудовании, предназначенных для изготовления фармацевтической продукции. При работе с сухими материалами и продуктами необходимы меры предосторожности для предупреждения возникнове­ния, накопления и распространения пыли, что может привести к перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть предотвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздельных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАВ) или, по крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспечением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защитной технологической одежды; использованием средств эффективной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием "закрытых систем" производства и т. д.Необходимо проверять правильность и надежность сочленения трубопроводов и другое оборудование, используемое для транс­портировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую. Вода, поступающая по трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ремонту не должны сказываться на качестве продукции. Контроль качества продукции касается процесса забора проб, проведения исследований, документации и пр. Все исследования должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для каждого материала или продукта. Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказываю­щемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора. Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься лабораторная документация с подтверждением соответствия конечного продукта спецификациям. Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года, превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком количестве, чтобы можно было при необходимости провести как минимум два повторных исследования.Третья часть требований GMP включает разделы о стерильных фармацевтических продуктах и практике качественного производства основной массы лекарственных субстанций.В 1991 г. правила GMP утверждены в нашей стране применительно к производству и контролю качества лекарственных средств. Эти правила соответствуют Международной Системе GMP и включают следующие разделы: введение, терминология, персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производства, отдел технического контроля, аттестация и контроль производства; выделены требования к стерильным лекарственным средствам и описаны особенности их производства.Соблюдение правил GMP обеспечивает выпуск качественных продуктов и гарантирует благополучие потребителей. В 1995 г. ВОЗ утверждена GPP (Good Pharmacy Practice) по предложе­нию Международной Фармацевтической Федерации (FIP).

22. Основы биотехнологии ферментов. Классификация по типу катализируемой ими реакции: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, синтетазы. Т.к очень трудно получить ферменты в гомогенном состоянии, а существующие препараты содер сопутствующие энзиматические активности. Сложилась практика классиф-ть ферменты по основному преобладающему компоненту: амилотические, липолитические (жиры), целлюлозолитические (клетчатка), протеолитические (белки). Натбольшая ферментная пром-ть развита в США, Японии, Германии, Дании. В отечеств практике сущест-т опред система названия ферментных препаратов, отражая основной фермент, источник его получения и степень очистки. Наименование конкретного препарата сост из сокращенного названия м/о продуцента и окончания –ин. Наприме: амиллолитич ферментный препарат, получаемый из культуры аспергиллюс наз-т амилолизин. Технология культивирования: ранее исп-ся поверхностный метод, когда организмы культивировали на пов-ти увлажненных стероидных отрубей. Стерилизацию вели в спец термостате. В посл 15 лет для выращивания продуцентов ферментов исп-т более экономный метод культивирования. Этот метод обладает многими преимуществами, те позволяет повысить эффективность использования, трудоемкие работы, автоматизировать весь процесс, увеличить масштабы производства. При глубинном способе культивирования, размножение посевного материала идет в 2 стадии: в цехе чистой культуры и в инокуляции. Причем количество питательной среды в аппарате не превышает 60% объема. Для посевных ферментаторов используют до 12% инокулята для общего объема среды. Постоянно контролируют режим, отбирают образцы для биохимич и м/б-го анализа. Посевной материал для основной ферментации готовят в количестве от 5-20% от объема.Сам процесс Мб гомогенным, непрерывным. Идет интенсивное перемешивание и параметры постоянного времени. Процесс Мб гетерогенным непрерывным. Когда несколько ферментеров соединены вместе. Питат среда поступает в 1-ый, а готовая культуральная жидкость вытекает из последней.

24. Традиционные методы создания продуцентов антибиотиков. Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается. Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов. 1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется. 2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня. 3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально. 4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать

развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате – обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста.

53. Соматостатин как рекомбенантный белок.(СТГ) СТГ – пептидный гормон из 191 аминокислоты, секретир. передней долей гипофиза. Впервые выделен из трупного материала, но много побочных и он был заражен вирусами, прирост ребенка составлял 6см, у некоторых детей вырабатывались антитела к препарату и эффективности не было. Разработали рекомбинантный СТГ(соматрем).он биол.чистый, не загрязнен вирусами. Синтезирован в ген-ки сконструированных кл-ках киш.палочки. Прирост детей 8-18см. 1-этап: клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщиплением фермента получили последовательность, кот.кодир.всю аминокислотную послед-ть гормона за искл.23 первых АМк-т. затем клонировали синтетич. полипептид, соотв-щий с 1 по23 амк-ту.2-этап: 2фрагмента объединяют, затем подстроили к паре специф.послед-ти в ДНК и участку связывания рибосом.

54. Зритропоэтин как рекомбенантный белок. Эритропоэтин – гормон гликопротеиновой природы, стимул-щий пролиферацию и дифференцировку эритропоэтин-чувствительных кл-к. состоит из165 амк-т. повышает уровень гемоглобина. Выделен впервые из мочи больного анемией, но получать из природных источников невозможно, т. к. низкое содержание в материале. Для получения рекомбинантного человеческого эритропоэтина, используют генно-инженерную технологию в культуре кл-к млекопитающих. Произ-во основано на комбинации иммуно-аффинной и ионно-обменной хроматографии.

55. Препараты рекомбинантного эритропоэтина. Рекомбинантные эритропоэтины и их аналоги Для стимуляции процессов эритропоэза медики используют разные препараты:«Аранесп»;«Аэприн»;«Эпобиокрин»;«Биоэин»;«Вепокс»;«Бинокрит»;«Эпокрин»;«Гемакс»;«Эпоген»;«Эпрекс»;«Эповитан»;«Эпомакс»;«Гиперкрит»;«Эральфон»;«Эритростим»;«Рекормон»;«Эпостим»;«Эпозино»;«Эпоэтин Бета». Показания к применению Практикующим медикам довольно часто приходится иметь дело с эритропоэтиндефицитными анемиями (ЭДА). В эту группу входят следующие патологии:анемия при злокачественных новообразованиях;ранняя анемия недоношенных малышей (до 34 недели беременности) с массой тела от 750 до 1500 г; нефрогенная анемия;анемия при хронических болезнях (гепатит С, ревматоидный артрит, ВИЧ-инфекция, болезни пищеварительного канала).

56. Биотехнология Цитокинов. Цитокины – большая гетерогенная группа белков с различными функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Интерфероны – группа эндогенных гликопротеидов, оказ-щие неспециф. противовирусное действие. Для получения используют 6-тидневные однослойные культуры кл-к куриного эмбриона. Создают систему вирус-клетка. Используют технологию рекомбинантных ДНК. Интерлейкины(ИЛ) – высокоочищенные цитокины. Конструирование рекомбинантных мол-л ИЛ осущ-ся набором специфичных ферментов. Маркерный фермент (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий очистку белка), входящий в состав химерного белка (продукт клонированного гена, защищенный амк-тами от расщепления ферментами клеток хозяина), очищают иммуноафинной хроматографией.

45. Геномика и Протеомика. Значение для целей фармации. Геномика - новая дисциплина, возникшая в конце 20в, с целью познания генома, те совокупности генов в организме. Задачи: установление полной генетич характеристики всей клетки,те количество содержащихся в ней генов, их последоват-ти, кол-ва нуклеотидов в каждом гене и их последовательности. Она позволяет выразить сущность организма, его потенциальные возможности, видовые отличия. Цель: получение информации о всех потенциал св-ах клетки, которые не реализуются в данный момент (молчащие гены).Геномика подразделяется на несколько направлений: - структурная (идентификация генов с помощью спец комплементарных программ). – функциональная (устанавливает связи между геномом и метаболизмом). – сравнительная (устанавливает является ли изученный ген уникальным или он был уже идентифицирован, получает сведения о степени гомологии родственных генов).

Протеомика с целью познания протеомы, те всей совокупности структур и каталитич белков в клетках эукариот и прокариот. Она дает возможность охарактеризовать клетку в данный момент, зафиксировать все находящиеся в ней белки, опр-ть функцион состояние клетки на уровне ее протеома, те совокупности всех фермент и структур белков работающих в данный момент. Протеомика позволяет следить за белковыми взаимодействиями, например: передача сигналов от поверхности скрининга. Позволяет получить более полную всестороннюю картину взаимодействия с клетко новых потенцированных а/микробных агентов. Она м.б названа продолжением геномики,те предметом ее изучения являются продукты кодируемые генами экспрессирующимися в данный момент.