Автоклавирование. Питательные среды стерилизуют главным образом в автоклавах насыщенным паром под давлением 0,05-0,2 МПа. Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация). Данный способ применяют для стерилизации питательных сред, изменяющих свой состав и свойства под действием температур выше 100 ºC. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды (или ее компонентов) проводят при 100 ºC три раза по 30 мин трое суток подряд. Кратковременное прогревание среды кипячением уничтожает в основном термолабильные вегетативные клетки микроорганизмов. Поэтому между нагреваниями питательные среды выдерживают при комнатной температуре (или в термостате при 30 ºC) и дают возможность прорасти оставшимся жизнеспособным спорам. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные клетки погибают при повторном кипячении. Продолжительность нагревания может быть увеличена до 45-60 мин, что зависит от объема жидкости. Стерилизация путем прерывистого нагрева была предложена английским физиком Джоном Тиндалем и получила название тиндализации. Среды необратимо изменяющиеся при кипячении, осторожно прогревают при более низкой температуре: при 60-80 ºC в течение 5 сут подряд по 30-60 мин или при 56-58 ºC на протяжении 6-7 сут, в первые сутки – 2 ч, в последующие – по 1 ч. Температурную обработку сред ведут на водяной бане или в ультратермостате, где температура автоматически поддерживается на определенном уровне с помощью специального устройства. В промежутках между нагревами среды выдерживают в обычном термостате при 30 ºC. Пастеризация. Пастеризация, или неполная стерилизация, предложена Луи Пастером. Она предназначена для уничтожения в основном аспорогенных микроорганизмов однократным прогреванием при температуре 60-75 ºC и выдержке 15-30 мин или при 80 ºC в течение 10-15 мин. Пастеризации подвергаются продукты и среды, которые при воздействии боле высоких температур претерпевают глубокие изменения, теряют качество и питательную ценность. Пастеризацию широко применяют в пищевой промышленности. Стерилизация фильтрованием. Стерилизацию жидких питательных сред, не выдерживающих даже незначительного нагревания, производят фильтрованием через специальные мелкопористые бактериальные фильтры. На бактериальных фильтрах задерживаются механические взвешенные примеси, в том числе и клетки микроорганизмов. Исключение составляют вирусы и фаги. Фильтрованию подвергают среды с белками, антибиотиками, витаминами, летучими веществами, а также культуральные жидкости с целью освобождения от клеток и сохранения всех продуктов метаболизма в неизменном виде. Фильтры изготавливают из положительно заряженных материалов.
16 Иммобилизация лекарственных средств. Иммобилизация - это повышение стабильности вещества. Она позволяет пролонгировать терапевтич действие, усилить эффект, уменьшить дозу и частоту введения ЛС. Она имеет свои особенности. Очень важен правильный выбор носителя, к которому выдвигается ряд требований: 1)носитель д. обладать устойчивостью к воздействию м/о; 2)дБ нетоксичным 3)д. иметь известный механизм распада в организме; 4) д.б изучены пути выведения носителя или его продуктов распада из организма; 5) д.б изучены побочное воздействие на организм. В качестве носителей исп-т сополимеры акриловых кислот, гепарины, ионообменные смолы. Выбор носителя и способа иммоб-ии д.подбираться с учетом способа введения ЛП. Чаще всего исп-т синтетические полимеры, которые д.иметь строго опред молекулярную массу. Полимеры не д.содержать остаточных мономеров, д. обладать однородностью. Полимеры носителей м. и сами обладать опред физиологич активностью. Например: поливинилпиридин и поливинол обл-т детоксикац действием. Иммобилизация ЛС способна изм-ть их свойства, особенно если эти вещества сложные белки. Увелич-ся их устойчивость к температурным изменениям, действию м/о.
18. Механизмы регуляции биосинтеза первичных и вторичных метаболитов, управление процессами. Общий компонент клеточной оболочки, присущим клеткам м/о,растений и жив-х, явл-ся цитоплазматическая мембрана-двухслойная фосфолипидная субклеточная структура с включенными в нее разнообразными по функциям белками.Системы регуляции транспорта из среды в клетку необходимых клетке вещ-в и системы выброса ненужных вещ-в из клетки в среду обяз-но связаны с цитоплазматической мембраной.Процессы транспорта ч/клеточную оболочку подразделяют на пассивную диффузию, облегченную диффузию и активный транспорт.При пассивной диффузии,в соответствии с градиенто концентрации,когда в среде концентрация выше,чем внутри клетки,в клетку проникает вода,УВ,молекулы O2,N,H2. При облегч-ой диффузии необходимые клетке в-ва переносятся из среды в клетку с помощью пермеаз-особого класса белков,содер-ся в мембране.Переносимое в-во реагирует с пермеазой на наружной стороне мембраны и освобождается после переноса через мембрану внутри клетки.В-во продвигается по градиенту концентрации,затрат энергии не требуется.При активном транспорте в-во в клетку,требующем затраты энергии, движение переносимого в-ва происходит против градиента концентрации.Если энергодающие р-ции блокируются реагирующим с функционал-ми группами белковой части ферментов, то активный транспорт в клетку низкомолекул-х в-в прекращается. Источником энергии д/активного транспорта явл-ся трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода.Переносчики,имеющие места связывания протонов и молекул субстрата, используют мембранный потенциал д/переноса внутрь клетки ионов водорода и пит-х в-в.Переносчик, связавшись с протоном,повышает свое сродство к субстрату. Освободившись от протона на поверхности мембраны, обращенной внутрь клетки, переносчик снижает сродство к субстрату.Такой транспотр называется «симпорт».Если переносчик осущ-т перенос только одного субстрата- наз-ся «унипорт».механизм транспорта одним и тем же переносчиком двух субстратов именуется «антипорт». АТФ-зависимые системы активного транспорта используют энергию АТФ.Самостоят-ый интерес представляет выведение из клети избыточных продуктов метаболизма, защитных ферментов, АБ и экзоферментов,позволяющих утилизировать находящиеся в среде полимеры.Низкомолек-ые в-ва выводятся путем пассивной или облегченной дифф-и.Сущ-ют и энергозависимые системы..Особый интерес вызывает проблема выведения из клетки белка,синтезируемого в цитоплазме,включая чужеродный белок,являющ-ся целевым продуктом.
20. Единая система GMPпри внедрении в практику ЛП. GMP – это единая система требований по контролю качества лекарственных средств с начала переработки сырья до производства готовых препаратов, включая общие требования к помещениям, оборудованию и персоналу. С 1975 г. правила GMP расширены, и они касаются различных химических и биологических веществ в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых в животноводстве; исходных материалов для использования в дозированных формах, если они включены в законодательства стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации о безопасности и эффективности перечисленных веществ, материалов и препаратов. Правила GMP включает три части:1) "Управление качеством в промышленном производстве лекарственных средств: философия и основные составляющие";2) "Практика качественного производства и контроль качества";3) "Дополнительные и вспомогательные направления". Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заключения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления необходимой документации и др. Вторая часть содержит два раздела – производство и контроль качества. Применительно к производству лекарственных средств указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения методов ведения технологического процесса согласно нормативно-технической документации с целью получения продукта требуемого качества и в соответствии с разрешением на его изготовление и продажу. По возможности избегать любых отклонений от методик или инструкций. При наличии таких отклонений необходимо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначенного ответственного лица, а при необходимости – привлечение службы отдела контроля качества.Операции с различными продуктами не должны выполняться, одновременно и последовательно в одном и том же помещении пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загрязнения. Доступ в производственные помещения должен быть ограничен лишь определенным кругом лиц, занятым в производстве. Избегать изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудовании, предназначенных для изготовления фармацевтической продукции. При работе с сухими материалами и продуктами необходимы меры предосторожности для предупреждения возникновения, накопления и распространения пыли, что может привести к перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть предотвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздельных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАВ) или, по крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспечением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защитной технологической одежды; использованием средств эффективной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием "закрытых систем" производства и т. д.Необходимо проверять правильность и надежность сочленения трубопроводов и другое оборудование, используемое для транспортировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую. Вода, поступающая по трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ремонту не должны сказываться на качестве продукции. Контроль качества продукции касается процесса забора проб, проведения исследований, документации и пр. Все исследования должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для каждого материала или продукта. Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказывающемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора. Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься лабораторная документация с подтверждением соответствия конечного продукта спецификациям. Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года, превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком количестве, чтобы можно было при необходимости провести как минимум два повторных исследования.Третья часть требований GMP включает разделы о стерильных фармацевтических продуктах и практике качественного производства основной массы лекарственных субстанций.В 1991 г. правила GMP утверждены в нашей стране применительно к производству и контролю качества лекарственных средств. Эти правила соответствуют Международной Системе GMP и включают следующие разделы: введение, терминология, персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производства, отдел технического контроля, аттестация и контроль производства; выделены требования к стерильным лекарственным средствам и описаны особенности их производства.Соблюдение правил GMP обеспечивает выпуск качественных продуктов и гарантирует благополучие потребителей. В 1995 г. ВОЗ утверждена GPP (Good Pharmacy Practice) по предложению Международной Фармацевтической Федерации (FIP).
22. Основы биотехнологии ферментов. Классификация по типу катализируемой ими реакции: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, синтетазы. Т.к очень трудно получить ферменты в гомогенном состоянии, а существующие препараты содер сопутствующие энзиматические активности. Сложилась практика классиф-ть ферменты по основному преобладающему компоненту: амилотические, липолитические (жиры), целлюлозолитические (клетчатка), протеолитические (белки). Натбольшая ферментная пром-ть развита в США, Японии, Германии, Дании. В отечеств практике сущест-т опред система названия ферментных препаратов, отражая основной фермент, источник его получения и степень очистки. Наименование конкретного препарата сост из сокращенного названия м/о продуцента и окончания –ин. Наприме: амиллолитич ферментный препарат, получаемый из культуры аспергиллюс наз-т амилолизин. Технология культивирования: ранее исп-ся поверхностный метод, когда организмы культивировали на пов-ти увлажненных стероидных отрубей. Стерилизацию вели в спец термостате. В посл 15 лет для выращивания продуцентов ферментов исп-т более экономный метод культивирования. Этот метод обладает многими преимуществами, те позволяет повысить эффективность использования, трудоемкие работы, автоматизировать весь процесс, увеличить масштабы производства. При глубинном способе культивирования, размножение посевного материала идет в 2 стадии: в цехе чистой культуры и в инокуляции. Причем количество питательной среды в аппарате не превышает 60% объема. Для посевных ферментаторов используют до 12% инокулята для общего объема среды. Постоянно контролируют режим, отбирают образцы для биохимич и м/б-го анализа. Посевной материал для основной ферментации готовят в количестве от 5-20% от объема.Сам процесс Мб гомогенным, непрерывным. Идет интенсивное перемешивание и параметры постоянного времени. Процесс Мб гетерогенным непрерывным. Когда несколько ферментеров соединены вместе. Питат среда поступает в 1-ый, а готовая культуральная жидкость вытекает из последней.
24. Традиционные методы создания продуцентов антибиотиков. Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно подается стерильный воздух, и среда перемешивается. Существует четыре основных модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов. 1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментаторе, после чего ферментатор освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется. 2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментаторах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости в ферментаторе и доводится свежей питательной средой до исходного уровня. 3. Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментаторов. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментатора во второй, затем из второго в третий и т. д. Освобожденный ферментатор немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально. 4. Непрерывное культивирование. В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать
развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения. Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии. В первом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем, чтобы получить высокоактивную биомассу, а во втором аппарате – обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста.
53. Соматостатин как рекомбенантный белок.(СТГ) СТГ – пептидный гормон из 191 аминокислоты, секретир. передней долей гипофиза. Впервые выделен из трупного материала, но много побочных и он был заражен вирусами, прирост ребенка составлял 6см, у некоторых детей вырабатывались антитела к препарату и эффективности не было. Разработали рекомбинантный СТГ(соматрем).он биол.чистый, не загрязнен вирусами. Синтезирован в ген-ки сконструированных кл-ках киш.палочки. Прирост детей 8-18см. 1-этап: клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщиплением фермента получили последовательность, кот.кодир.всю аминокислотную послед-ть гормона за искл.23 первых АМк-т. затем клонировали синтетич. полипептид, соотв-щий с 1 по23 амк-ту.2-этап: 2фрагмента объединяют, затем подстроили к паре специф.послед-ти в ДНК и участку связывания рибосом.
54. Зритропоэтин как рекомбенантный белок. Эритропоэтин – гормон гликопротеиновой природы, стимул-щий пролиферацию и дифференцировку эритропоэтин-чувствительных кл-к. состоит из165 амк-т. повышает уровень гемоглобина. Выделен впервые из мочи больного анемией, но получать из природных источников невозможно, т. к. низкое содержание в материале. Для получения рекомбинантного человеческого эритропоэтина, используют генно-инженерную технологию в культуре кл-к млекопитающих. Произ-во основано на комбинации иммуно-аффинной и ионно-обменной хроматографии.
55. Препараты рекомбинантного эритропоэтина. Рекомбинантные эритропоэтины и их аналоги Для стимуляции процессов эритропоэза медики используют разные препараты:«Аранесп»;«Аэприн»;«Эпобиокрин»;«Биоэин»;«Вепокс»;«Бинокрит»;«Эпокрин»;«Гемакс»;«Эпоген»;«Эпрекс»;«Эповитан»;«Эпомакс»;«Гиперкрит»;«Эральфон»;«Эритростим»;«Рекормон»;«Эпостим»;«Эпозино»;«Эпоэтин Бета». Показания к применению Практикующим медикам довольно часто приходится иметь дело с эритропоэтиндефицитными анемиями (ЭДА). В эту группу входят следующие патологии:анемия при злокачественных новообразованиях;ранняя анемия недоношенных малышей (до 34 недели беременности) с массой тела от 750 до 1500 г; нефрогенная анемия;анемия при хронических болезнях (гепатит С, ревматоидный артрит, ВИЧ-инфекция, болезни пищеварительного канала).
56. Биотехнология Цитокинов. Цитокины – большая гетерогенная группа белков с различными функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Интерфероны – группа эндогенных гликопротеидов, оказ-щие неспециф. противовирусное действие. Для получения используют 6-тидневные однослойные культуры кл-к куриного эмбриона. Создают систему вирус-клетка. Используют технологию рекомбинантных ДНК. Интерлейкины(ИЛ) – высокоочищенные цитокины. Конструирование рекомбинантных мол-л ИЛ осущ-ся набором специфичных ферментов. Маркерный фермент (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий очистку белка), входящий в состав химерного белка (продукт клонированного гена, защищенный амк-тами от расщепления ферментами клеток хозяина), очищают иммуноафинной хроматографией.
45. Геномика и Протеомика. Значение для целей фармации. Геномика - новая дисциплина, возникшая в конце 20в, с целью познания генома, те совокупности генов в организме. Задачи: установление полной генетич характеристики всей клетки,те количество содержащихся в ней генов, их последоват-ти, кол-ва нуклеотидов в каждом гене и их последовательности. Она позволяет выразить сущность организма, его потенциальные возможности, видовые отличия. Цель: получение информации о всех потенциал св-ах клетки, которые не реализуются в данный момент (молчащие гены).Геномика подразделяется на несколько направлений: - структурная (идентификация генов с помощью спец комплементарных программ). – функциональная (устанавливает связи между геномом и метаболизмом). – сравнительная (устанавливает является ли изученный ген уникальным или он был уже идентифицирован, получает сведения о степени гомологии родственных генов).
Протеомика с целью познания протеомы, те всей совокупности структур и каталитич белков в клетках эукариот и прокариот. Она дает возможность охарактеризовать клетку в данный момент, зафиксировать все находящиеся в ней белки, опр-ть функцион состояние клетки на уровне ее протеома, те совокупности всех фермент и структур белков работающих в данный момент. Протеомика позволяет следить за белковыми взаимодействиями, например: передача сигналов от поверхности скрининга. Позволяет получить более полную всестороннюю картину взаимодействия с клетко новых потенцированных а/микробных агентов. Она м.б названа продолжением геномики,те предметом ее изучения являются продукты кодируемые генами экспрессирующимися в данный момент.