Это - самый сложный, тонкий и, пожалуй, самый капризный метод хроматографии. Но зато, в случае успеха, - фантастически эффективный! С его помощью в одной хроматографической операции удается полностью очистить вещество, представленное в смеси с другими компонентами ничтожной долей - порядка нескольких сотых процента.
Аффинный означает родственный (от латинского af finis) или, точнее, обладающий сродством. Аффинная связь в нашем случае подразумевает биоспецифическое взаимодействие, отличающееся исключительной избирательностью. Такая избирательность лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме.
В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и антителами к ним, между многими малыми молекулами, например, витаминами и специфическими транспортными белками, доставляющими их в клетку.
Наконец, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, управляющими реализацией их функций: редупликацией, транскрипцией и трансляцией.
Любой из компонентов названных и им подобных биоспецифических пар можно надежно закрепить на хроматографической матрице в качестве так называемого "лиганда". С его помощью второй партнер такой пары может быть извлечен из смеси с другими, не комплементарными лиганду веществами и временно задержан на матрице в составе биоспецифического (аффинного) комплекса.
После удаления всех посторонних примесей промывкой тем же элюентом, в котором осуществлялось образование этого комплекса, можно произвести замену элюента на такой, который нарушит биоспецифическую связь лиганда с его аффинным партнером. Это обеспечит быстрый выход последнего из колонки, на которой останется освобожденный для новых аффинных связей лиганд.
|
|
Биоспецифическое взаимодействие реализуется за счет тех же, хорошо знакомых нам сил связи, которые фигурировали в рассмотренных ранее видах хроматографии: электростатического притяжения разноименных ионов, водородных связей и сил гидрофобного взаимодействия.
Биоспецифичность определяется конформационным соответствием участков связывания на лиганде и веществе, в результате которого различные их взаимодействия осуществляются одновременно в нескольких точках и их эффекты суммируются.
Одна из тонкостей постановки опытов с использованием аффинной хроматографии заключается в создании условий, когда ни одна из этих нескольких связей не будет излишне прочной. В противном случае вещество не удастся "снять" с лиганда.
Вся суть метода заключается в конформационном соответствии. Ни одна из связей не является специфичной. Поэтому их разрыв при элюции очищенного вещества может быть осуществлен с помощью обычных приемов: изменением рН, увеличением ионной силы (иногда и температуры) элюента, введением в его состав органических растворителей и детергентов.
В некоторых случаях может потребоваться вмешательство денатурирующих агентов (мочевина, формамид), нарушающих само конформационное соответствие пары лиганд - вещество.
Из сказанного ясно, что главное преимущество аффинной хроматографии состоит в ее очень высокой избирательности. Вместе с тем, сам способ связывания вещества с матрицей через лиганд в условиях конформационного соответствия является, как правило, идеально мягким и, в отличие от других видов хроматографии, не угрожает нативности очищаемого вещества, например, его ферментативной активности.
|
|
Действительно, здесь фермент "садится" в точно соответствующую его конфигурации "ямку", между тем, как в ионообменной или распределительной хроматографии связывание с сорбентом хотя бы только в двух, но случайно расположенных, точках может существенно деформировать молекулу фермента.
В тех "некоторых случаях", когда элюцию фермента не удается осуществить без его денатурации, можно пойти по пути ослабления первичного биоспецифического связывания. Например, заменить в качестве лиганда истинный субстрат фермента на его аналог.
Немаловажным преимуществом аффинной хроматографии является и то обстоятельство, что в ней гидролитические ферменты (протеазы и нуклеазы) с самого начала отделяются от своих субстратов.
В частности, этим обстоятельством обусловлен высокий выход при очистке макромолекулярных препаратов. Кроме того, ввиду избирательной сорбции малой доли вещества, находящегося в исходной смеси, аффинную хроматографию отличает возможность использования больших объемов исходных препаратов. В ходе ступенчатой элюции осуществляется весьма эффективное концентрирование нужного вещества.
Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания лиганда с матрицей не должен создавать стерических препятствий для осуществления его аффинного взаимодействия с сорбируемым веществом.
|
|
Если в качестве лиганда выступает биополимер (белок или нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закрепления на матрице, проблема не возникает.
Однако если в качестве лиганда используется низкомолекулярный субстрат, кофермент или гормон, то близость его расположения к матрице может создавать стерические препятствия для правильной ориентации белка, взаимодействующего с таким лигандом.
В результате степень аффинного сродства вещества к обменнику может уменьшиться и даже упасть до нуля. В таких случаях необходимо биологически активный лиганд удалить от матрицы, вводя между ними тонкую "ножку", например, линейную цепочку метиленовых остатков (... - СН2-СН2-СН2..) или иную подходящую структуру, так называемого " спейсера""
Хотя принцип аффинной хроматографии очень прост, из приведенных кратких замечаний легко понять, что "конструирование" аффинного обменника для очистки нужного вещества является делом деликатным. Необходимо разумно выбрать матрицу, найти способ щадящего и, вместе с тем, надежного (как правило химического) закрепления на ней лиганда.
Если необходимо, то закрепления через спейсер, который тоже нужно выбрать наилучшим образом как в отношении его размера и степени гидрофильности, так и в отношении способов его связывания с матрицей и лигандом.
Разумеется, для многих частных, а также и общих случаев эта задача решена усилиями фирм, выпускающих аффинные сорбенты. Номенклатура их непрерывно расширяется и приводить ее здесь не имеет смысла.
Тем более, что каждый исследователь, понимающий исключительные возможности аффинной хроматографии, должен быть готов к тому, чтобы сконструировать аффинный обменник для решения своей особой задачи.
Литература
1. Душкин М.П., Иванова М.В. Трансформация перитонических макрофагов в пенистые клетки при внутрибрюшном введении мышам липопротеидов низкой плотности, холестерина и его продуктов окисления. // Патофизиология и эксперимент. терапия. - 1993. - N 2. - С.9-11.
2. Дятловская Э.В., Безуглов В.В. Липиды как биоэффекторы. Биохимия. 1998. Т.67. вып.1. - С. - 3-6.
3. Ершова Л.П., Курбанова Г.Н., Горбунова Н.А. О механизмах посттравматической анемии. // Пат. физиология. 1992. - N 2. - С. - 54-55.