Практикум «Микроскопия окрашенных микропрепаратов»
Красители в микробиологии применяются для выделения отдельных клеточных структур за счет специфического химического взаимодействия характерных для тех или иных клеточных органелл веществ с красителем или их смесью, для изучения морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов.
В процессе окрашивания играют роль как физические, так и химические факторы.
Окраска микроорганизмов — комплекс методов изучения структуры и морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур или исследуемого материала с помощью красителей.
Фиксированные бактерии окрашиваются лучше живых, так как клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана живой клетки ограничивают проникновение в нее красителя, поддерживая состояние гомеостаза.
Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов:
1) приготовление мазка;
2) высушивание мазка;
3) фиксацию мазка;
4) окраску (с промывкой)
5) высушивание
6) микроскопию
Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см2.
Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки.
Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта и эфира — по Никифорову).
После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой (иногда спиртом).
Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и также может долго храниться.
Основные виды красителей, которые применяются в микробиологической практике:
| Дают следующее окрашивание | ||||
| красное | голубое (синее) | фиолетовое | желто-коричневое | зеленое |
| фуксин основной, нейтральный красный, конго красный | метиленовый и толуидиновый синий | генциан-виолет, метиленовый фиолетовый | хризоидин, везувин | бриллиантовый зеленый, малахитовый зеленый |
Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней.
Механизм и этапы окраски по Граму
1. На фиксированный мазок нанести краситель генциан-виолет. Через 1 минуту экспозиции перейти к п.2.
2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин (это раствор йода).
3. Обесцветить (промыть) этиловым спиртом в течение 30-60 сек. до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Возможно дополнительно промыть мазок водой.
5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин,
6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. /См. учебное видео!/
Пример окраски – грамположительные клостридии в мазке из отделяемого раны больного с газовой гангреной.
Механизм и этапы окраски по Цилю-Нельсону
1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.
2. Промыть мазок водой
3. Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.
4. Промыть мазок водой
5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин
6. Промыть водой, высушить и микроскопировать
Некислоустойчивые – обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный.
Пример окраски – микобактерии туберкулёза в мазке мокроты больного.
Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бурри. Для этого черную тушь смешивают c культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд.
Пример – окраска по Гинсу возбудителей пневмонии – пневмококков (материал из мокроты). При микроскопии наблюдается бесцветная капсула.
Окраска по Леффлеру. Способ метахроматического выявления волютиновых зерен у коринебактерий (см. термин «метахромазия» - свойство клеток или их фрагментов окрашиваться в цвет, отличающийся от цвета самого красителя). Для окраски используют щелочной раствор метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин на фиксированный мазок, после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Протоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна - в темно-синий. Пример – возбудитель дифтерии.
Окраска по Нейссеру. Метод выявления волютиновых зерен у коринебактерий. Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим, 10 - 30 секунд обрабатывают раствором Люголя (раствор йода), слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 секунд раствором везувина (желто-коричневое окрашивание), высушивают и микроскопируют. Бактерии окрашиваются в желтый цвет, а волютин -в темно-синий. Пример – возбудитель дифтерии.
Окраска риккетсий по Здродовскому. Окраску производят карболовым фуксином в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе 0,01% соляной кислоты в течение 2—3 секунд. Затем препарат промывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленового синего в течение полминуты. В препарате на синем фоне будут видны окрашенные в красный цвет риккетсии. Пример – возбудитель сыпного тифа.
Окраска по Романовскому—Гимзе. Краска Гимзы — смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленового синего), эозина и метиленовой сини. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную цитоплазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий — в красно-фиолетовый цвет.
Окраска по Романовскому—Гимзе является одним из основных методов при изучении морфологии простейших, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.
Способ применения. К 10 мл дистиллированной воды перед окрашиванием препарата прибавляют 10 капель краски Гимзы и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют.
Пример – окраска возбудителя сифилиса в бледно-розовый цвет.