Биопринтинг. Основные понятия, термины
Биопринтинг – технологический раздел биофабрикации (см. определение)
1. Это биомедицинское применение быстрого прототипирования (rapid prototyping) или послойной трехмерной печати (новой парадигмы всеобщей технологической революции) с целью решения проблемы получения копий живых органов для последующей пересадки пациенту.
2. Это роботизированная (управляемая компьютером) технология или цифровая трехмерная печать. По определению Миронова, «Биопечать есть автоматический, управляемый компьютером процесс послойной депозиции/включения живых и биологически уместных/релевантных материалов с целью быстрого производства функционально состоятельных органов человека»
3. Подготовленный на компьютере графический дизайн органа (blueprint) в стандартном формате обмена данными 3D-графики является обязательным атрибутом биопринтинга.
4. Это технология, на современном этапе развития исключающая использование твердых скаффолдов для обеспечения тканевой целостности. Созданные ("напечатанные") трехмерные тканевые биоконструкты должны формировать тканевую фиброзную основу самостоятельно без дополнительного полимерного скелета/матрикса.
5. Это технология биопроизводства, основанная на принципах синтетической анатомии: от частного к общему через воссоздание органной структуры согласно известным законам физиологии и биологии развития.
6. Фундаментальные биологические принципы, лежащие в основе биопринтинга, позволяющие рассчитывать на получение копий органов таким способом, базируются на явлении тканевого слияния (взаимного сплавления) отдельных тканевых блоков. Близко расположенные тканевые сфероиды (эмбриональные тела) имеют тенденцию сливаться (спаиваться) в единую массу. Этот процесс управляется (запускается) силами поверхностного натяжения и белкового межклеточного взаимодействия. Это есть повсеместно распространенное физическое явление в процессе живого развития организмов: таким путем формируются у эмбриона аорта, нервная трубка, мягкое небо носоглотки, верхняя губа и т.д.
7. Основа развития биопечати как дисциплины – мультидисциплинарность, то есть, сочетание практических и теоретических знаний из разных областей науки: инженерного дела, механики, общей биологии, биологии развития, эмбриологии, биохимии, прикладной биотехнологии и информатики. Без объединения разносторонних специалистов и обмена информацией на взаимно понятном им языке невозможно развитие биопечати как технологического направления.
8. Концепт быстрого/ускоренного вызревания тканей - этот другой краеугольный камень концептуальной базы технологии Organ Printing, - с физической точки зрения является явлением фазового перехода: индуцированного перехода от жидкой/подвижной фазы к твердому состоянию.
9. Organ printing использует внутреннюю способность человеческих тканей к самоорганизации/самосборке. Это направленная самоорганизация. Такие фундаментальные биологические принципы технологии Organ Printing, как тканевое слияние, проявлены в биологической самоорганизации/самосборке.
Термин "самосборка" был дан George Whitesides из Harvard University в следующем определении: "Самосборка является автономной организацией неких компонентов в прототипы и структуры без вмешательства человека извне"
Биопечать помещает сфероиды близко рядом друг с другом (задание направления), а им остается только сливаться (осуществлять самосборку)
По мнению Миронова В.А. будущее клеточных технологий за использованием аутологичных клеткок взрослого человека. Во-первых, лучший банк для хранения клеток пациента – это он сам. Во-вторых, технологии репрограммирования позволяют исправлять те недостатки генома, которые возникли за время жизни пациента. В-третьих, аутологичные клетки не имеют искусственно привнесенного риска новообразований по сравнению с эмбриональными клетками.
Используемые термины и определения.
Тканевый сфероид. Упругий сгусток из живых клеток (от 1000 до 10 000 единиц) размером 200-300 мкм, который используется в работах Форгача, Миронова, Вэня и других исследователей в качестве основного материала для биофабрикации. По сути, это кирпичик тканевого здания, которое создается в искусственных условиях. Тканевые сфероиды в простом варианте получаются путем содержания/инкубации суспензии клеток (стволовых, фибробластов, гепатоцитов, миоцитов и др.) в небольшом объеме культуральной среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Для простого масштабирования используют инкубацию суспензии в плоских сосудах, содержащих в себе полимерные биоинертные формы в виде пчелиных сот, круглых или тороидальных колодцев. Более сложные технологии масштабирования при получении тканевых сфероидов в больших количествах основаны методах микрофлюидики или вибрационной генерации капель.
ADSC. Стволовые клетки адипозной (жировой) ткани. По большинству своих свойств эквивалентны стволовым клеткам костного мозга (marrow stem cells, MSC). В силу возможности одномоментного получения большого количества этих клеток от пациента мини-инвазивно с помощью липоаспирации, ADSC представляют собой наилучший с точки зрения доступности клеточный материал для биопечати.
Липоаспирация. Хирургический минимально-инвазивный метод получения адипозной ткани пациента в косметологии, с биопсийными или исследовательскими целями. В качестве инструмента для липоаспирации наиболее часто используется ультразвуковой липосактор.
Биофабрикация:
1. производство живых биотканей и органов искусственно, с помощью разработанных в лаборатории технологий.
2. название одноименного журнала.
Синтетическая анатомия. В отличие от классической анатомии, описательной по сути и анализирующей органы и структуры от совокупного к частному, синтетическая анатомия занята построением концепции работы органов от частного к совокупному на основе разработанного плана по достижению требуемой функции получаемого конструкта
Scaffold. Обозначает резорбируемый (деградируемый) тканевой или полимерный скелет/матрикс, который:
1. Служит пространственной и субстратной основой для возникновения новой ткани в биофабрикации. Характерным примером скаффолда может служить применяемый активно в регенеративной нейрохирургии коллагеновый матрикс Duragen производства Integra
2. Служит объемной основой для напыления/нанесения дифференцированных или стволовых клеток при моделировании кожи, хряща, кости.
Для достижения цели реконструкции тканей скаффолды должны соответствовать некоторым специфическим требованиям. Высокая порозность и адекватный размер пор являются необходимым условием для обеспечения клеточного заселения и диффузии сквозь толщу имплантата как клеток, так и нутриентов (питательных жидкостей).
Graft - обобщенное обозначение трансплантата, независимо от природы его происхождения, наполнения или назначения. Может быть synthetic (искусственный), xenogenic (из тканей животных, главным образом свиной или говяжий), allogenic и autogenic.
Lockyball – в данном контексте это клеточный сфероид, заключенный в полимерную оболочку, получаемую с помощью стереолитографии. Оболочка выполнена в виде ажурной сферической конструкции с отростками на манер шипов репейника. Такие шипы служат скрепляющим механическим средством при составлении тканевых конструктов для мгновенного обеспечения более высокой механической прочности, которая не достижима с помощью существующих гидрогелей, требующих для полимеризации некоторого времени и цитотоксичных фотоактиваторов.
Биореактор. Аппарат для выращивания/культивирования или поддержания в жизнеспособном состоянии клеточных и тканевых структур/совокупностей.
Биопринтер. Аппаратный комплекс, диспенсер для послойного нанесения биочернил согласно 3D-плану, разработанному на компьютере.
Биочернила – суспензия тканевых сфероидов в гидрогеле, полученных в результате «самосборки» из суспензии одиночных клеток
Биобумага – в контексте биопринтинга, гидрогелевая подложка слоя тканевых сфероидов, выступающая в роли мягкого матрикса/скаффолда и скрепляющего сфероиды агента.
TGFbeta1 Transforming growth factor beta 1, фактор клеточной/тканевой дифференциации. Используется для ускорения вызревания тканевых образцов
PLGA, PLLA, PLA - полимеры молочной кислоты, материал для изготовления скаффолдов. Используются в основном в виде нанофибриллярных (нано-нитевых, неплетеных) пленок/мембран или в водном растворе в составе гелей.
Клеточная пропагация - процесс получения большого количества однородного вида клеточного материала.
Форсунка Фишмана. Шнековая (шнек - винтовой толкатель) форсунка, используемая в трехмерных ink-jet принтерах Форгача, Вэня, Миронова, применяемых в экспериментальной работе с клеточным материалом. Позволяет получать точное и управляемое/регулируемое выделение жидкого материала (биочернил) через капилляр в нано-литровых количествах, что выгодно отличает форсунку Фишмана от форсунки Нордсона. Винтовой толкатель (шнек) приводится в действие шаговым двигателем, управляемым в свою очередь микропроцессором.
Форсунка Нордсона. В результате получения патента на принцип пневмораспылителя/пульверизатора, компания Nordson в мире ассоциируется именно с последним, а имя компании стало нарицательным относительно всех устройств, где используется пневмораспыление воздушной струей. Применительно к биопринтингу форсунка Нордсона не имеет вид обычного воздушного пневмораспылителя, поскольку для дозирования материала в объеме нанолитра он оказывается слишком грубым. Для решения такой тонкой задачи воздух по-прежнему выступает как действующая физическая сила, однако уже не для распыления вещества, а для привода диафрагмы толкателя, который в свою очередь уже ответственен за точное дозирование биочернил в микро- и нанолитровых количествах.
Электроспиннинг (электроформование). Технология производства полимерных нанонитей (волокон субмикронной толщины) путем их вытяжения из капли расплава/раствора полимера электростатическим полем высокой напряженности.
TESA. Tissue engineering by self assembly. Технология создания графта/трансплантата путем свободной самоорганизации/самосборки клеток ткани в биореакторе без участия человека с последующей трансформацией (физической или химической) полученного материала перед имплантацией. Например, выращивание фиброзной пленки с помощью культуры фибробластов, а затем сворачивание ее в трубочку с покрытием эндотелиоцитами, чтобы получить ткане-инженерный трансплантат кровеносного сосуда.
Васкуляризация. Проблема создания графта/трансплантата с уже готовым капиллярным/сосудистым деревом, позволяющим ему оставаться функционально пригодным/валидным в физиологической среде реципиента.
Клеточная потенция.
Тотипотентность – способность клетки при делении воссоздавать все без исключения виды дифференцированных клеток организма. Из клеток, обладающих такой потенцией, можно получить как любые дифференцированные ткани, так и целиком эмбрион. Как правило, такая возможность у клеток есть лишь на стадии зиготы.
Плюрипотентность – способность клетки при делении образовывать клеточные линии основных зародышевых листков: эндодермы, мезодермы, эктодермы. Из плюрипотентных клеток также могут получаться большинство дифференцированных клеток взрослого организма, однако получение эмбриона целиком, как в случае с тотипотентными клетками, уже исключено. Эта клеточная потенция характерна для стволовых клеток зародышей/эмбрионов. Может быть искусственно приобретена дифференцированными клетками в результате биохимической активации или перепрограммирования генома, (индуцированная плюрипотентность).
Поли/мультипотентность – способность клетки при делении образовывать некоторые клеточные линии дифференцированных клеток взрослого организма, однако строго ограниченный спектр линий. Например, мезенхимальные (стромальные) стволовые клетки, которые при определенных условиях равновероятно могут дифференцироваться в хондроциты, остеобласты и адипоциты.
Олигопотентность – согласно логике по уменьшению потенции, способность клетки образовывать всего несколько (строго ограничено) дифференцированных линий. Например, внутрисосудистые стволовые клетки образовывают в равной степени эндотелиальные и гладкомышечные клетки.
iPSC – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Наряду с ADSC (MSC) могут являются основным источником (в аутологичном случае) клеточного материала для получения тканевых сфероидов и изготовления биочернил для биопринтинга.
Основные факторы, используемые при получении iPSC:
Oct3/4 (также известен как POU5F1 – транскрипционный фактор №1 POU-домена пятого класса) – белок, ключевой фактор считывания генома (транскрипции), уровень экспрессии которого управляет судьбой эмбриональных клеток в развитии. Играет важную роль в процессе самообновления недифференцированных эмбриональных клеток
Sox2 – фактор, существенный для поддержания процесса самообновления у недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Обнаруживается у развивающихся клеток нейрональной трубки эмбриона, а также во время пролиферации/разрастания клеток-предшественников ЦНС
Nanog - это транскрипционный фактор, участвующий в самообновлении недифференцированных эмбриональных стволовых клеток. Потеря функции Nanog вызывает дифференцировку эмбриональных стволовых клеткок в другие типы клеток. Повышенная экспрессия Nanog в человеческих эмбриональных стволовых клетках обеспечивает их многократный пересев, при этом клетки остаются плюрипотентными. Последнее обстоятельство весьма важно для клеточной пропагации iPSC с целью масштабирования способов получения клеточного материала для целей биопринтинга.
STAT3 – белок, английская аббревиатура «передатчик сигналов и активатор транскрипции №3» Обладает высоким анти-апоптозным и пролиферативным эффектом.
APC/b-catenin – белок межклеточного взаимодействия, связанный с фактором опухолевой супрессии APC. Позволяет управлять клеточной пролиферацией.
c-Myc - белок-регулятор транскрипции до 15% всех генов. Регулирует структуру генома, изменяя ацилирование (реакции по изменению числа СО-окончаний аминокислот) связанных с ДНК белков.
Лентивирусы - разновидность ретровирусов, способных доставлять значительное количество генетического материала в клетку хозяина. Обладают уникальной среди ретровирусов способностью реплицироваться/размножаться в неделящихся клетках, что делает лентивирусы удобным вектором для доставки генетического материала в молекулярной биологии.