МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Институт биологии, экологии и природных ресурсов
реферат по дисциплине цитология
«Метод фракционирования (ультрацентрифугирования)»
Выполнил(а):
Студент(ка) группы Б-171
Бернт К. В.
Нагулина О. А.
Проверила:
доцент
Мейер Алина Викторовна
Кемерово 2018
Оглавление
Введение. 3
Центрифугирование. 3
Типы ультрацентрифугирования. 4
Центрифугирование в градиенте плотности. 6
Типы роторов. 7
Дифференциальное центрифугирование. 9
Фракционирование клеточных структур. 10
Клеточная инженерия. 12
Заключение. 12
Список литературы.. 14
Введение
Одним из самых распространенных методов изучения природных и синтетических полимеров является метод ультрацентрифугирования.
Ультрацентрифугирование (ultracentrifugation, лат. ultra- — приставка, обозначающая «больше», «сверх», «за пределами», centrum — средоточие, центр и fuga — бегство, бег) - метод разделения и исследования частиц размером менее 100 нм (макромолекул, органелл животных и растительных клеток, вирусов и др.) в поле центробежных сил с помощью ультрацентрифуги.
Ультрацентрифугирование позволяет разделять смеси частиц на фракции или индивидуальные компоненты, определять их молекулярную массу, оценивать форму и размеры макромолекул в растворе и др.
Центрифугирование
В клинических и санитарно-гигиенических лабораториях центрифугирование используют для отделения эритроцитов от плазмы крови, сгустков крови от сыворотки, плотных частиц от жидкой части мочи и т. д. Для этой цели применяют или ручные центрифуги, или центрифуги с электроприводом, скорость вращения которых можно регулировать.
Различные лабораторные центрифуги: клиническая, настольная, угловая малогабаритная, стационарная, рефрижераторная.
Лабораторная клиническая центрифуга имеет три скорости вращения (1000, 1500, 3000 об/мин). Ротор-крестовина приспособлен для 12 обычных центрифужных пробирок. Наибольший объем центрифугируемой жидкости — 150 мл.
Лабораторная настольная центрифуга имеет угловой ротор на шесть коротких пробирок общей емкостью 72 мл. Максимальная скорость вращения —9000 об/мин.
Угловая малогабаритная центрифуга имеет три сменных угловых ротора с различным количеством пробирок и гематокрит: ротор для 6 пробирок общей емкостью 150 мл, ротор для 10 пробирок общей емкостью 120 мл, ротор для 24 пробирок общей емкостью 120 мл, гематокрит для двух капилляров. Максимальная скорость вращения— 10 000 об/мин.
Лабораторная стационарная центрифуга имеет два сменных ротора. Ротор-крестовина снабжен четырьмя стальными гильзами емкостью по 500 мл и четырьмя стеклянными пробирками к ним емкостью по 250 мл. Угловой ротор снабжен 8 полиэтиленовыми и стальными пробирками емкостью 50—75 мл. Максимальное вращение роторов до 6000 об/мин. Центрифуга снабжена электрочасовым механизмом.
К числу специальных центрифуг относится лабораторная рефрижераторная центрифуга, предназначаемая для центрифугирования при пониженных температурах (- 5° и выше). Центрифуга имеет три сменных ротора, обеспечивающих различные режимы центрифугирования.
Типы ультрацентрифугирования
Принято различать 2 типа ультрацентрифугирования: препаративное и аналитическое.
Препаративное центрифугирование используется в случае, когда необходимо выделить часть образца для дальнейших исследований. Этот метод применяется для выделения клеток из суспензии, биологических макромолекул и т.д. Широко используют ультрацентрифугирование в градиенте плотности растворов сахарозы, глицерина, декстринов; оно позволяет разделять смеси веществ на отдельные компоненты, различающиеся эффективной массой и коэффициентом трения частиц или молекул.
Скорость до 75000 об/мин и максимальное угловое ускорение 510000g. Они снабжены как холодильником, так и вакуумной установкой, чтобы предотвратить перегрев воздуха вследствие трения его о воздух. Роторы таких центрифуг изготавливают из высокопрочных алюминиевых и титановых сплавов. Для уменьшения вибраций, возникающих вследствие неравномерного наполнения пробирок, ультрацентрифуги имеют гибкий вал. Пробирки для центрифугирования и их содержимое должны быть тщательно уравновешены с точностью до 0,1г.
Аналитическое центрифугирование применяется для изучения поведения биологических макромолекул в центробежном поле. Данный метод позволяет получить данные о массе, форме и размерах молекул, находящихся в относительно небольших объемах образца.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70000 об/мин, при этом ускорение до 500000g. Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с двигателем, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Ротор вращается в вакуумной камере снабженной холодильной установкой, и имеет две ячейки аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально параллельно оси вращения.
Скоростные центрифуги имеют предельную скорость 25 тыс. об/мин. и ускорение до 89 тыс.
Камеры, в которой находится ротор и центрифугируемые образцы, оснащают системой охлаждения для предотвращения нагревания, возникающего от трения при вращении ротора на больших скоростях.
Основные методы центрифугирования
Частицы в растворе осаждаются (седиментация), когда их плотность выше плотности раствора, или всплывают (флотация), когда их плотность ниже плотности раствора. Чем больше разница в плотности, тем быстрее идет распределение частиц. Когда плотности частиц и раствора одинаковые (изопикнические условия), частицы остаются неподвижными. При малой разнице в плотности частицы можно разделить только в центрифуге, которая создает центробежную силу, во много раз превышающую силу земного притяжения.
Роторы. Возникающая в центрифуге центробежная сила, которая, строго говоря, создается ускорением, обычно выражается числом, кратным ускорению свободного падения g (g = 9,81 м/с2). Величины до 10000g получают с помощью простой настольной центрифуги, высокоскоростные рефрижераторные центрифуги позволяют достигнуть 50000g, а ультрацентрифуги, работающие сохлаждением и в вакууме, — 500000g. Существуют два типа роторов — угловые и свободно подвешенные, так называемые бакет-роторы. Последние используются обычно в высокоскоростных центрифугах и ультрацентрифугах.
Скорость седиментации частицы (ν) зависит от угловой скорости (ω), эффективного радиуса ротора rэфф(расстояние от оси вращения) и седиментационных свойств частиц.
Седиментационные свойства частицы характеризуются коэффициентом седиментации S и выражаются в единицах Сведберга (1S = 10-13с). На схеме справа показано соотношение между плотностью и коэффициентом седиментации для различных частиц в растворе хлорида цезия (CsCI). Величина S может колебаться в широких пределах. Для сравнения коэффициентов седиментации в различных средах их обычно корректируют по плотности и вязкости воды при 20oC (S20w).
Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы (М) частицы, ее формы (коэффициент трения f), парциального удельного объема ΰ (величина, обратная плотности частицы).