Мутационный процесс и поток генов могут создать в популяции изменчивость по единичным генам. Если в результате таких первичных процессов возникает аллельная изменчивость по двум или большему числу генов, то создаётся почва для действия вторичного процесса — рекомбинации, В результате рекомбинации новые аллели, носителями которых первоначально, вероятно, были разные особи, могут сочетаться в одном генотипе. За счет рекомбинации число различающихся генотипов в популяции может увеличиться; этот процесс превращает небольшой первоначальный запас изменчивости по множественным генам в гораздо более значительное количество генотипической изменчивости.
Процесс рекомбинации
Допустим, что в популяции диплоидных организмов, размножающихся половым путем, в двух независимо распределяющихся генах А и В возникли новые мутации. Допустим далее, что носителями мутантных аллелей (а и b) первоначально были разные особи с генотипами АаВВ и ААВb соответственно. Теперь может начаться процесс рекомбинации, слагающийся из следующих этапов: 1) скрещивание между носителями различных мутантных аллелей: АаВВ×ААВb; 2) появление в F1 гетерозигот по двум генам АаВb (помимо других типов); 3) независимое распределение гамет с образованием четырёх классов гамет — АВ, Аb, аВ и ab; 4) образование в F2 девяти различных генотипов — ААВВ, …, aabb.
Большую часть этих девяти генотипов составляют новые генотипы. В начале процесса в популяции было три генотипа (ААВВ, АаВВ и ААВb); спустя два поколения она содержала девять генотипов, в том числе такие новые рекомбинантные типы, как ааВb и aabb,
Для того чтобы произошла рекомбинация, гены А и В необязательно должны быть независимы. Гены A и B могут рекомбинироваться, находясь в разных хромосомах или же в разных локусах одной хромосомы. Сцепление, если только оно не слишком тесное, снижает частоту рекомбинаций, но не предотвращает их образования.
|
Следует сказать несколько слов о терминологии. В рекомбинации генов участвуют два процесса: независимое распределение негомологичных хромосом и кроссинговер между негомологичными хромосомами. Молекулярные биологи и микробиологи, используя термин рекомбинация, имеют в виду исключительно второй процесс. Биологи, имеющие дело с организмами и популяциями, используют этот термин в его классическом смысле, т. е. имея в виду как сцепленные, так и несцепленные гены; именно в этом смысле мы пользуемся им в этой книге.
Конъюгация
Конъюгацией у прокариот называется прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту.
Процесс конъюгации был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Э. Татумом.
У кишечной палочки клетка-донор («мужская») имеет продолговатую форму, клетка-реципиент («женская») – изодиаметрическую. Клетка-донор образует половые ворсинки (пили), которые притягивают ее к клетке-реципиенту и образуют цитоплазматические каналы. По этим каналам ДНК из клетки-донора переходит в клетку-реципиент. Существует три типа клеток-доноров: F+ (эф–плюс), Hfr (эйч–эф–а) и F′ (эф–прим).
F+ -доноры содержат в цитоплазме половой фактор – специфическую F–плазмиду.
F–плазмида – это автономный репликон длиной около 100 тпн. В составе F–плазмиды изучено более 20 генов. Примерно половина из них образует гигантский оперон tra (длиной около 30 тпн); продукты этого оперона контролируют образование контакта между донором и реципиентом и собственно перенос ДНК. Остальные гены регулируют работу tra–оперона.
|
Клетка-реципиент не содержит F–плазмиды и обозначается как F– –клетка.
При образовании цитоплазматического мостика одна из цепей F–плазмиды надрезается в определенной точке (точка О), а на комплементарной цепи начинается репликация ДНК по принципу «катящегося кольца». Копия комплементарной цепи по цитоплазматическому мостику переходит в цитоплазму клетки–реципиента, и на ней достраивается недостающая цепь. После окончания репликации двунитевая плазмидная ДНК замыкается в кольцо, и F– –клетка превращается в F+ –клетку. Полное время переноса копии F–плазмиды в клетку–реципиент составляет примерно 5 минут.
Однако при скрещивании F+ × F– в клетку–реципиент попадают только гены, содержащиеся в F–плазмиде; гены домашнего хозяйства, локализованные в бактериальной хромосоме, в клетку–реципиент не переносятся.
В то же время F–плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому, то есть переходить в интегрированное состояние. В бактериальной хромосоме имеется около 20 сайтов интеграции F–плазмиды. Тогда при переносе копии одной из цепей F–плазмиды в клетку–реципиент за ней увлекается и копия одной из цепей бактериальной хромосомы. Клетки с интегрированной F–плазмидой называются Hfr–доноры (от англ. «высокая частота рекомбинаций»). В зависимости от условий возможен полный или частичный перенос копии бактериальной хромосомы Hfr–донора в цитоплазму реципиента. В результате образуется клетка с одной исходной двунитевой бактериальной хромосомой и одной полной или неполной гомологичной однонитевой молекулой ДНК. Такая клетка называется мерозигота («частичная зигота»). Далее при репликации ДНК протекает рекомбинация. Этот процесс принципиально не отличается от рекомбинации при трансформации.
|
Перенос копии ДНК начинается примерно с середины F–плазмидной ДНК (с точки О, в которой одна из цепей ДНК надрезается, и начинается репликация F–плазмидной ДНК). Таким образом, половина F–плазмидной ДНК проникает в клетку–реципиент в начале конъюгации, а вторая половина – только после полного переноса копии хромосомной ДНК. Для полного завершения этого процесса при t = 37 0С требуется более 100 минут. Однако в природных условиях конъюгация прерывается значительно раньше, в клетку–реципиент переходит только часть копии хромосомы донора и только первая половина F–плазмидной ДНК. Таким образом, клетка-реципиент не принимает свойства Hfr–донора.
Однако существуют штаммы бактерий, у которых копия бактериальной хромосомы вместе с копией F–плазмидной ДНК переносится полностью. Такие клетки называются vHfr–доноры (от англ. «очень высокая частота рекомбинаций»).
Вероятность переноса определенного гена в клетку–реципиент зависит от его удаления от F–плазмидной ДНК, а точнее, от точки О, в которой начинается репликация F–плазмидной ДНК. Чем больше время конъюгации, тем выше вероятность переноса данного гена. Это дает возможность составить генетическую карту бактерий в минутах конъюгации. Например, у кишечной палочки ген thr (оперон из трех генов, контролирующих биосинтез треонина) находится в нулевой точке (то есть непосредственно рядом с F–плазмидной ДНК), ген lac переносится через 8 мин, ген recE – через 30 мин, ген argR – через 70 мин и т.д.
F–плазмида может переходить из интегрированного состояния в автономное путем самовырезания из бактериальной хромосомы. В этом случае возможен захват и части хромосомной ДНК (до 50 % хромосомных генов). F–плазмида, включающая хромосомные гены, называется F′ –фактором. Перенос генетического материала при скрещиваниях F′ × F– называется сексдукция.
Кроме F–плазмиды у прокариот известны и другие типы половых факторов (R, Ent, Hly, Col), обеспечивающих перенос генетического материала от бактерии к бактерии. На основе природных плазмид (в том числе ДНК хлоропластов и митохондрий) получены полусинтетические молекулы ДНК, обеспечивающие перенос генетического материала из одной клетки в другую, называются векторы. Векторы должны обеспечивать не только устойчивый перенос генов, но и регуляцию их транскрипции.
Прокариотические плазмиды могут реплицироваться только в прокариотических клетках. В то же время, существует необходимость переноса генов от эукариот к прокариотам и наоборот. Для этого используются челночные плазмиды, которые содержат два репликатора (прокариотический и эукариотический) и способны реплицироваться и в прокариотических, и в эукариотических клетках, например, Ti– и Ri–плазмиды, способные к репликации в прокариотических и растительных клетках, и полусинтетические векторы, созданные на их основе. Для защиты векторов от разрушения нуклеазами их заключают в фосфолипидные пузырьки – липосомы.
При картировании генов у бактерий с помощью конъюгации получается кольцевая генетическая карта хромосомы. Значение генетиче ских карт позволяет планировать работу по получению организмов с определенными сочетаниями признаков, что используется в генетических экспериментах селекционной практике. Сравнение генетических карт хромосом разных видов способствует эволюциоонному процессу. На основе же генетических карт проводят генетический анализ. Методы картирования хромосомы при конъюгации: по градиенту передачи маркеров, по времени их вхождения в мерозиготу, по частоте кроссинговера.
Кольцевая хромосома (ring chromosome) - Естественная структура хромосом у многих прокариот, некоторых вирусов, а также молекул ДНК, входящих в состав пластид и митохондрий эукариот – замкнутая двухцепочечная молекула ДНК. У некоторых вирусов кольцевая хромосома состоит из одноцепочечной молекулы ДНК. Также кольцевая хромосома – структурная хромосомная аберрация, появляющаяся в результате мутаций, ведущих к образованию «липких концов» по крайней мере с частичной комплементарностью; мелкие кольцевые хромосомы образуются при фрагментациях и (крайний случай) пульверизации хромосом.