Химический состав бактериальной клетки.
Микроорганизмы возникли в процессе эволюции из элементов, широко представленных на Земле. Химический состав бактериальной клетки принципиально не отличается от химического состава клеток животных и растений. Соотношение отдельных химических элементов колеблется в зависимости от вида микроорганизма и условий его роста.
Вода – 75-85% (составляет основную массу микробной клетки, биохимические функции воды аналогичны таковым у эукариотов: часть воды находится в связанном состоянии с белками, углеводами и другими веществами, входя в состав клеточных структур; остальная вода находится в свободном состоянии – служит дисперсной средой для коллоидов и растворителем различных органических и минеральных соединений, с водой все вещества поступают в клетку и выводятся из нее).
Сухое вещество – 15-25%, состоит из органических веществ и минеральных элементов:
Ø органические вещества:
v белки – 50-80% (основные компоненты клетки, в бактериальной клетке насчитывается более 2 тыс. различных белков, представлены в виде простых (протеины) и сложных (протеиды) соединений, функции их аналогичны белкам эукариот – входят в состав различных структур клетки, являются строительным материалом и выполняют ферментативные функции);
v нуклеиновые кислоты – 10-30% (представлены в виде РНК и ДНК – ДНК обеспечивает наследственность и изменчивость бактерий, а РНК ответственны за биосинтез клеточных белков);
v углеводы – 12-28% (содержатся в виде моно-, ди- и полисахаридов, а также связаны с белками и липидами, входят в состав клеточных структур, используются для синтеза различных веществ и в качестве энергетического материала, часто откладываются в виде запасных питательных веществ);
v липиды – 3-10%, у некоторых бактерий, например, микобактерий – возбудителей туберкулеза и лепры, содержание липидов достигает до 30-40% (представлены в трех фракциях – фосфолипиды, воски и жирные кислоты, являются необходимыми компонентами клеточной стенки и ЦПМ, также используются для синтеза различных веществ).
Ø минеральные вещества – 5-15%, по количественному содержанию у бактерий можно разделить на 4 группы:
v макробиогенные элементы (2-60%): азот, водород, кислород, углерод – составляют основу органических веществ, поэтому называются органогенными;
v олигобиогенные элементы (0,02-0,1%): калий, натрий, хлор, сера, магний, железо, кальций, фосфор;
v микробиогенные элементы (0,01%): цинк, марганец, кобальт, медь, фтор, бром, йод;
v ультрамикробиогенные элементы (<0,01%): бор, ванадий, кремний, литий, алюминий, олово, мышьяк, молибден.
Олиго, микро- и ультрамикробные элементы рассматривают как зольные. Минеральные (зольные) вещества играют большую роль в регулировании внутриклеточного осмотического давления и коллоидного состояния цитоплазмы, влияют на скорость и направление биохимических реакций (активаторы ферментов/ко-ферменты), являются стимуляторами роста.
Все перечисленные химические вещества образуют малые и большие молекулы:
Ø малые молекулы:
v молекулы-предшественники, поступающие в клетку извне: H2O, CO2, N2, ионы Mg2+, Ca2+, K+, Cl-, NO3-, SO42-, PO42- и другие;
v промежуточные молекулы органических кислот;
v молекулы строительных блоков: аминокислоты, мононуклеотиды, простые сахара, глицерин, жирные кислоты.
Ø большие молекулы (макромолекулы):
v белки;
v нуклеиновые кислоты;
v полисахариды;
v липиды.
У прокариотов имеются новые соединения, не встречающиеся в клетках эукариот: пептидогликан, корд-фактор, дипиколиновая кислота, тейхоевые и липотейхоевые кислоты и т.д.
Пигменты бактерий.
Пигменты бактерий – это специфические фоторецепторные молекулы, вторичные метаболиты, образующиеся на свету и придающие бактериям окраску. (Наличие у бактерий пигментов обычно связано с их способностью существовать за счет энергии света. Некоторые микроорганизмы утратили способность к фотосинтезу, но сохранили пигменты. Способность образовывать пигменты детерминирована генетически и используется в качестве диагностического признака. Образование пигментов зависит от состава среды и условий культивирования. У многих микроорганизмов образование пигмента происходит только на свету. Пигменты различают по химическому составу и цвету.)
Классификация пигментов по химическому составу и цвету:
| Химический состав | Цвет | Пигментообразующие микроорганизмы |
| Хиноновые | Желтый | Микобактерии |
| Азахиноновые (индигоидин) | Синий | Коринеактерии, псевдомоны, артробактерии |
| Каротиноиды | Красный, оранжевый, желтый, белый | Сарцины, актиномицеты, стафилококки, микрококки, коринебактерии, дрожжи |
| Меланиновые | Черный, коричневый | Бактероиды, порфиромоны |
| Пирроловые (продигиозин) | Ярко-красный | Серрации |
| Фенозиновые (пиоцианин) | Сине-зеленый (щелочная среда) или красный (кислая среда) | Синегнойная палочка |
| Пиразиновые (пульхерримин) | Темно-красный | Кандида |
Классификация пигментов по растворимости:
Ø жирорастворимые (каротиноидные, хиноновые, азахиноновые);
Ø водорастворимые (фенозиновые, пиразиновые) – хромопарные (способны диффундировать в окружающую среду и окрашивать не только колонии, но и питательные среды);
Ø спирторастворимые (каротиноидные, пирроловые);
Ø нерастворимые ни в воде, ни в сильных кислотах (меланиновые).
Значение пигментов:
Ø защита от действия видимого света и УФ-лучей;
Ø ассимилируют углекислый газ;
Ø обезвреживают токсичные кислородные радикалы;
Ø участвуют в синтезе витаминов;
Ø обладают антибиотическим действием и свойствами биологически активных веществ;
Ø цвет пигмента используют в идентификации бактерий.
Типы питания бактерий.
Особенности питания бактерий:
v экзогенный тип питания (выделяя гидролитические ферменты в окружающую среду, расщепляют макромолекулы до более простых соединений, которые поступают внутрь клетки);
v голофитный тип питания (поступление веществ из вне только в растворенном состоянии);
v поступление веществ происходит через всю поверхность бактериальной клетки;
v потребление веществ в сутки в 20-30 раз больше своей массы;
v интенсивность метаболизма у прокариотов выше, чем у эукариотов на 50-60% (в 100 раз);
v очень высокая адаптивность к различным условиям существования.
Для микроорганизмов характерно многообразие способов питания. Классификация микроорганизмов по типам питания:
1. По источнику углерода:
Ø автотрофы = «сами себя питающие» (от греч. autos – сам, trophe – пища) способны получать весь углерод в результате фиксации CO2 (единственный источник углерода – СО2 воздуха);
Ø гетеротрофы=«питающиеся за счет других» (от греч. heteros – другой) получают углерод из различных органических соединений, эта группа наиболее многочисленна по своему составу, включает паразитов и сапрофитов:
v паразиты (паратрофы, от греч. parasitos – нахлебник ) используют для своего питания органические соединения живых организмов, обитают на поверхности или внутри макроорганизма, нанося ему вред, подразделяются на:
· облигатные паразиты – полностью лишены способности жить вне клеток макроорганизма;
· факультативные паразиты – могут существовать и вне макроорганизма;
v сапрофиты (метатрофы, от греч. sapros – гнилой, phyton – растение ) нуждаются в готовых органических соединениях, поэтому питаются мертвой тканью животных и растений.
2. По источнику энергии:
Ø фототрофы (фотосинтезирующие) используют энергию солнечного света;
Ø хемотрофы (хемосинтезирующие) получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций.
3. По донору электронов:
Ø литотрофы (от греч. lithos – камень) в качестве источника электронов используют неорганические соединения (H2, NH3, H2S, S и т.д.);
Ø органотрофы используют органические соединения в качестве доноров электронов.
Можно использовать все критерии сразу для характеристики микроорганизмов или только два. Например, фотоавтолитотрофы – микроскопические водоросли; хемоорганогетеротрофы – стафилококки, кишечная палочка. Однако, такая классификация не полностью отражает способности микроорганизмов. Многие микроорганизмы обладают «гибким» метаболизмом и могут переключаться в определенных условиях с одного способа питания на другой. Поэтому выделяют термины облигатный и факультативный, так например, облигатному фотоавтотрофу обязательно нужен свет и CO2 как источник углерода, а факультативные фотоавтотрофы могут расти и на органических кислотах.
4. По источнику азота:
Ø аминоавтотрофы используют атмосферный азот и минеральные соединения азота для построения органических соединений (почвенные бактерии);
Ø аминогетеротрофы получают азот для синтеза белков из органических соединений (патогенные бактерии).
5. По способности синтезировать необходимые питательные вещества:
Ø прототрофы – это микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические соединения из глюкозы и солей аммония;
Ø ауксотрофы не способны синтезировать некоторые органические соединения, ассимилируя их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина.
Факторы роста – это вещества, необходимые микроорганизмам, не продуцирующим какое-либо вещество, в готовом виде для их роста и размножения:
v аминокислоты (стептококки);
v пуриновые и пиримидиновые основания (стрептококки, микоплазмы, лактобациллы);
v витамины (никотиновая, пантотеновая и фолиевая кислоты, флавин, тиамин, биотин, В6 и В12 – микобактерии туберкулеза);
v железопорфирины;
v липиды (микоплазмы);
v соли.
Механизм поступления веществ в клетку ( сложный физико-химический процесс, в котором большую роль играют концентрация веществ, их строение, растворимость, размеры молекул, проницаемость ЦПМ, наличие ферментов, pH среды, изоэлектрическая точка вещества цитоплазмы ):
Ø пассивная диффузия – питательные вещества в клетку перемещаются по градиенту концентрации без затрат энергии (когда концентрация вещества снаружи значительно превышает концентрацию внутри); этим путем в бактериальную клетку поступает ограниченное количество веществ – H2O, O2, CO2 и NH3;
Ø облегченная диффузия осуществляется тоже по градиенту концентрации без затрат энергии, но с помощью особых белков-пермеаз, которые находятся в цитоплазматической мембране;
Ø активный транспорт осуществляется пермеазами против градиента концентрации (концентрация вещества в клетке может быть значительно больше, чем в питательной среде), сопровождается затратой энергии;
Ø транслокация (фосфорилирование) – химическая модификация вещества при переносе через ЦПМ с помощью белков-транслоказ; так, например, поступает в клетки глюкоза;
Ø обменная адсорбция – способность электрически заряженной поверхности микробной клетки притягивать вещества с противоположным зарядом.
Выход продуктов метаболизма из микробной клетки:
Ø диффузия (пассивная, облегченная, активная);
Ø экзоцитоз – путем почкования мембраны – выделяемое вещество упаковано в мембранный пузырек и отшнуровывается в окружающую среду; например, токсин холерного вибриона;
Ø фосфотранспорт – химическая модификация вещества при переносе через ЦПМ.
Ø контрансляционная секреция – внутри клеточной стенки и ЦПМ формируется белковый канал, через который молекулы вещества выделяются наружу, например, токсины возбудителей столбняка и дифтерии.
Ферменты бактерий.
Ферменты – это высокоспециализированные белки, специфически катализирующие многочисленные химические реакции, происходящие в микробной клетке.
Классификация бактериальных ферментов:
Ø По механизму действия:
v оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции (перенос электронов);
v трансферазы катализируют реакции, идущие с переносом молекул или атомных группировок от одних соединений к другим;
v лиазы катализируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от них H2O, CO2 и NH3;
v гидролазы катализируют реакции гидролитического расщепления и синтеза органических веществ, идущие с участием H2O;
v изомеразы осуществляют внутримолекулярные перемещения радикалов и атомов, превращая органические соединения в их изомеры;
v лигазы (синтетазы) катализируют реакции синтеза сложных органических соединений из простых.
Ø По локализации:
v экзоферменты – ферменты, выделяемые наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул, которые способны проходить через ЦПМ;
v эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.
Ø По субстрату воздействия:
v сахаролитические;
v протеолитические;
v липолитические.
Ø По концентрации в окружающей среде:
v конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;
v индуцибельные (адаптивные) – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;
v репрессибельные – это ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.
Ферменты патогенности – это ферменты, субстратами для которых являются вещества, входящие в состав клеток и тканей макроорганизма, способствующие проникновению, распространению и размножению микроорганизмов, т.е. проявлению патогенных свойств (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза).
Методы изучения ферментативной активности.
В бактериологической практике для идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.
Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:
Ø среды Гисса (пестрый ряд):
v жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;
v полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;
v короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);
v длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).
Ø среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S.
Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.
Ø среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным соответственно.
У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными.
Для определения протеолитических ферментов используют:
Ø определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак);
Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:
v индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;
v H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;
v о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.
Ø способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);
Ø способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.