Письменно ответим на вопросы к практикуму:
1. Что такое вирусный капсид?
2. С чем связана симметричность капсида?
3. Какие типы симметрии различают?
4. Опишите/зарисуйте основные типи симметрии.
5. На какие 2 подтипа по типу нуклеиновой кислоты классифицируют вирусы?
6. Какие особенности забора и транспортировки биоматериала на вирусологическое исследование?
7. Кратко охарактеризуйте вирусоскопический метод исследования.
8. Опишите основной и наиболее достоверный - вирусологический метод исследования.
9. Как осуществляется оценка цитопатического действия (ЦПД) вирусов?
10. Как осуществляется проведение цветной пробы?
11. Опишите суть метода бляшек.
12. Как ставятся реакции РГА и РГАд?
13. Кратко охарактеризуйте биологический метод исследования при вирусных инфекциях.
14. Охарактеризуйте серодиагностику вирусных инфекций.
15. Какие современные методы еще используются при диагностике вирусных инфекций?
16. Приведите пример вирусов с оболочкой и без оболочки, однонитевых РНК- и однонитевых ДНК-вирусов. Двунитевых ДНК- и двунитевых РНК-вирусов.
Морфология, структура вирусов; типы симметрии:
Генетический материал вирусов упакован в специальный симметричный футляр — капсид. Капсид представлен белковой оболочкой, состоящей из повторяющихся субъединиц. Основные функции капсида — зашита вирусного генома от внешних воздействий, обеспечение адсорбции вириона к клетке, проникновение его в клетку путём взаимодействия с клеточными рецепторами.
Капсид образуют одинаковые по строению субъединицы — капсомеры, организованные в один или два слоя по типам симметрии — кубическому, спиральному ли смешанномуС. Симметричность капсида связана с тем, что для упаковки генома требуется большое количество капсомеров, а компактное их соединение возможно лишь при условии симметричного расположения субъединиц. Формирование капсида напоминает процесс кристаллизации и протекает по принципу самосборки.
Кубическая симметрия. У подобных вирусов нуклеиновая кислота окружена капсомерами, образующими фигуру икосаэдра – многогранника с 12 вершинами, 20 треугольными гранями и 30 углами. Организация по принципу кубической симметрии придаёт вирусам сферическую форму. Принцип кубической симметрии – самый экономичный для формирования замкнутого капсида, так как для его организации используются сравнительно небольшие белковые блоки, образующие большое внутреннее пространство, в которое свободно укладывается нуклеиновая кислота.
Спиральная симметрия. В нуклеокапсиде взаимодействие нуклеиновой кислоты и белка осуществляется по одной оси вращения. Каждый вирус со спиральной симметрией обладает характерной длиной, шириной и периодичностью нуклеокапсида. Нуклеокапсиды большинства патогенных для человека вирусов имеют спиральную симметрию. Организация по принципу спиральной симметрии придаёт вирусам палочковидную форму. При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает наследственную информацию, но требует большого количества белка, так как покрытие состоит из сравнительно крупных блоков.
Двойная (смешанная) симметрия. Некоторые бактериофаги (вирусы бактерий) имеют двойную симметрию: головка организована по принципу кубической симметрии, хвост – по принципу спиральной симметрии. Длина хвоста обычно в 2—4 раза больше диаметра головки. В головке содержится генетический материал — одноцепочечная или двуцепочечная РНК или ДНК с ферментом транскриптазой в неактивном состоянии, окружённая белковой или липопротеиновой оболочкой — капсидом, сохраняющим геном вне клетки.
По международной классификации все вирусы подразделяются по типу нуклеиновой кислоты на 2 подтипа: РНК- и ДНК-содержащие. Дальнейшее разделение вирусов происходит по размеру, типу симметрии, наличию или отсутствию внешних оболочек и количеству содержащихся в них капсомеров.
В каждом случае заболевания с подозрением на вирусную этиологию в первую очередь надо выделить возбудителя из патологического материала. В этой связи правильный отбор, упаковка, транспортировка и обработка материала имеют важное значение для успешной постановки диагноза. Взятые пробы необходимо как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса (т.е. низкую температуру или консервант). Для этого пробирки (или флакончики) с пат.материалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждающей смесью или в термоконтейнер-холодильник. В качестве охлаждающей смеси используют смесь равных частей сухого льда и этилового спирта. Можно использовать смесь, состоящую из трех частей льда или снега и одной весовой части поваренной соли. Вместо замораживания можно использовать химические консерванты (что хуже сохраняет вирус).
Вирусоскопический метод исследования позволяет выявить в исследуемом материале характерные для того или иного вируса патологические изменения клеток, а иногда и характерные внутри- и внекоеточные скопления вирусных частиц. (Связан с развитием микроскопии – иммунофлюоресцентный метод, электронная микроскопия). При специальной окраске препарата в световой микроскоп также могут быть видны тельца Бабеша-Негри (см.рис.) в нейронах гиппокампа умершего от бешенства. Выявление телец Арагао (скопление вируса Varicellovirus) в окрашенных серебрением по Морозову мазках жидкости везикул больного ветряной оспой при обычной или электронной микроскопии.
Вирусологический метод исследования является основным и наиболее достоверным, он позволяет выделить вирус из исследуемого материала с последующей его идентификацией. С целью накопления вирусосодержащего материала используются куриные эмбрионы и культуры тканей (искусственно культивируемые клетки той или иной ткани). Культур тканей поддерживаются на различных питательных средах, приготовленных на основе солевых буферных растворов Хенкса и Эрла. Вирусы могут репродуцироваться только в клетках живого организма. В связи с этим вирусы культивируются путём заражения куриных эмбрионов или культур тканей, а также некоторых лабораторных животных.
Для выявления вируса используют: методы оценки цитопатического действия вирусов, цветную пробу в культуре ткани, тесты гемагглютинации и гемадсорбции.
Оценка цитопатического действия (ЦПД) вирусов. Если в пат.материале имеется вирус, репродуцирующийся в данных клетках и приводящий к их гибели, то о наличии вируса судят по его поражающему на клетки действию, выражающемуся в видимых в световой микроскоп изменениях. См. рисунок культуры клеток: а – нормальный рост, б – цитопатическое действие вируса. ЦПД может быть трех основных типов: а) кругло- или мелкоклеточная дегенерация; б) образование гигантских многоядерных клеток - симпластов; в) образование внутриядерных или цитоплазматических включений.
Проведение цветной пробы. Принцип метода основан на определении кислых продуктов метаболизма, накаливающихся в клетке в процессе ее жизнедеятельности с помощью индикатора фенолового красного, меняющего свой цвет с красного в щелочной среде на оранжево-желтый в кислой среде. При заражении культуры клеток вирусами, вызывающими ЦПД (например, аденовирусы, энтеровирусы и др.), метаболизм клеток подавляется, рН среды не меняется и она остается окрашенной в красный цвет.
Проведение бляшкообразования. Метод бляшек основан на том, что в монослое клеток, зараженных вирусом, под тонким агаровым покрытием, содержащем краситель, появляются светлые участки разной формы, состоящие из дегенеративных клеток, которые утратили способность удерживать краситель. Эти участки получили название «бляшек».
Проведение РГА – реакции гемагглютинации.
Вирусы, за счет наличия поверхностных гемагглюттининов способны агглютинировать (склеивать)эритроциты. Реакцию ставят в лунках планшета, см. рисунок.
Проведение гемадсорбции. (РГАд) - сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов в результате действия гемагглютининов, входящих в состав суперкапсида вируса. РГАд можно наблюдать при малом увеличении микроскопа.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ метод исследования. Используют преимущественно новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражение животных проводится по принципу цитотропизма вируса. Индикация вируса основана на проявлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических изменениях в тканях и органах, а также на положительной реакции гемагглютинации с экстрактами из органов.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ метод исследования. В серодиагностике вирусных инфекций используют подход «парных сывороток», что позволяет определить нарастание титра (прирост антител) за определенный период заболевания с помощью набора вирусных диагностикумов. Парные сыворотки- две сыворотки, взятые от одного больного в начале заболевания и через 1-4 недели. Серологические реакции (РПГА, РСК, РТГА, РН, ИФА и др.) ставят одновременно с двумя сыворотками для определения и сравнения их титров.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ методы - выявление вирусной нуклеиновой кислоты с помощью метода молекулярной гибридизации и ПЦР.