Методические рекомендации к лабораторной работе по выделению нуклеиновых кислот из клеток растений
Теоретическая часть
В клетках растений геномная ДНК находится в ядре, цитоплазматическая – в митохондриях и пластидах. Кроме того, клетках присутствуют различные виды РНК. Молекулы геномной ДНК имеют большой размер и в клетке находятся в комплексе с белками – гистонами, образуя дезоксиробонуклеопротеин. Благодаря этому ДНК упакована в компактные структуры хроматина. Различный виды РНК также связаны с белками, образуя рибонуклеопротеины.
Получение нуклеиновых кислот состоит из четырёх основных этапов:
1. Гомогенизация образца.
При этом для разрушения тканей и клеток могут использоваться механическое воздействие и химические вещества, в том числе лизирующие ферменты. Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток. Плазматическая мембрана состоит из двух слоев фосфолипидов, которые ведут себя как жиры, не смешиваясь с водой. Клеточные мембраны разрушаются детергентами (моющими средствами) После разрушения мембраны клетки и внутриклеточных мембран нуклеиновые кислоты становятся доступными для выделения. Рекомендуется использовать недорогие детергенты, включающие в свой состав додецисульфат натрия (SDS, C12H25NaO4S).
Для механического разрушения образца обычно пользуются ступкой с пестиком, но можно применять блендер или даже размять мягкий фрукт в полиэтиленовом пакете.
2. Фильтрация полученного гомогената для очистки от не растворившихся фрагментов.
Наиболее быстро фильтрация проводится через сложенную в 4-8 слоев марлю. Также можно использовать фильтровальную бумагу, фильтры для кофе-машин, бумажные полотенца.
3. Отделение белков от нуклеиновых кислот.
От белков нуклеин-протеинового комплекса обычно избавляются фенольной депротеинизацией образца, что неприменимо в школе из-за токсичности и канцерогенности реактивов. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ, которые дороги. Наиболее приемлемые варианты – использование ацетата аммония или гидролитических ферментов бромелаин (из сока плодов и стеблей ананаса), фицин (из сока плодов инжира), актинидин (из сока киви), папаин (из сока папайи), широко применяемых в пищевой промышленности для тендеризации (размягчения) мяса при изготовлении колбасных изделий. Для отделения ДНК и РНК от белков используется ацетат аммония. Ацетат аммония продаётся как биоразлагаемый реагент – антиобледенитель для обработки автодорог.
4. Осаждение нуклеиновых кислот и очистка от примесей.
Метод, используемый в лабораторной работе, основан на способности нуклеопротеидов растворяться в солевых растворах большой ионной силы и выпадать в осадок неполярных растворителях. В результате работы выделяются нуклеиновые кислоты в смеси с белками – дезоксирибонуклеопртеиды и рибонуклеопротеиды.
Вместе с ДНК из клеток частично выделяется и РНК, от которой избавляются с помощью фермента РНКазы (рибонуклеазы). Наиболее доступный путь получение рибонуклеазы – использование одноименного медицинского препарата, безрецептурно реализуемого в аптечной сети. Рибонунклеаза как протеолитический препарат продаётся в виде раствора для инъекций и местного применения либо в виде хорошо растворимого порошка белого или белого с кремовым оттенком цвета. В данных рекомендациях мы приводим упрощенную методику выделения нуклеиновых кислот, без обработки рибонуклеазой, поскольку это реагент, который существенно повышает затратность лабораторной работы.
Используемые реактивы и методика не требуют специализированного оборудования и дорогих реактивов, но зачастую не позволяют добиться полного разрушения белков и очистки от них нуклеиновых кислот. Поэтому в заключительной части работы оценивается чистота выделенных нуклеиновых кислот с помощью качественных реакций.
Практическая часть
Цель: получить препарат нуклеиновых кислот из клеток растений и доказать наличие в нём нуклеиновых кислот
Оборудование: штатив с пробирками, ступка с пестиком, стеклянный порошок или мелкий прокалённый песок, кристаллизатор, мерные цилиндры объёмом 50 и 300 мл, деревянные или стеклянные палочки, марля для фильтрования, пипетки ёмкостью 1 мл, водяная баня
Материалы и реактивы: хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, детергент (моющее средство для посуды), дистиллированная вода, колотый лёд, 96%-ный этиловый спирт (охлаждённый до –20°С), дифениламиновый реактив (1 г дифениламина растворить в 100 мл ледяной уксусной кислоты и к раствору прилить 2,75 мл концентрированной серной кислоты), 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди (II), 10:-ный раствор ацетата аммония, образцы растительных тканей.
Приготовление буферного раствора для гомогенизации образца растительных тканей. Буфер для гомогенизации имеет нейтральный рН. Для приготовления буферного раствора в стеклянный химический стакан наливаем 120 мл дистиллированной воды, добавляем 1,5 г хлорида натрия (1/4 ч.л. поваренной соли) и 5 г гидрокарбоната натрия (1 ч.л. питьевой соды).
Ход работы
1. Приготовьте смесь для гомогенизации образца. Для это к 50 мл солевого буфера прилейте 5 мл детергента (моющего средства). Смесь перемешайте в течение 3 мин и дайте отстояться 2 мин для осаждения пены и выхода пузырьков воздуха.
2. Поставьте охлаждённый в морозильной камере этиловый спирт в кристаллизатор со льдом.
3. Измельчите растительный образец. Наденьте перчатки. Перчатки предотвращают попадание ферментов дезоксирибонуклеазы с рук в образец не допускают разрушения ДНК на фрагменты. Порежьте мытый фрукт или овощ среднего размера на кубики не более 3 см шириной. Измельчите в ступке 5-10 г образца. Для растирания образца добавляется песок или стеклянный порошок. Если образец содержит мало сока, добавьте немного воды.
4. Перенесите измельчённый образец в химический стакан и прилейте к нему полученную для гомогенизации смесь. Аккуратно размешайте раствор и дайте ему отстояться 10-15 мин, чтобы произошёл лизис клеточных структур. В это время сделайте записи в таблице.
5. Профильтруйте раствор через марлю, сложенную в 4 слоя. Следите за тем, чтобы пена осталась на марле. После разрушения клеточных стенок и клеточных мембран полученный раствор, содержит ДНК, РНК, полисахариды, белки, жиры и другие высокомолекулярные соединения. Кроме того в нём есть твердые фрагменты, от которых необходимо избавиться.
6. Прилейте к полученному фильтрату раствор ацетата аммония или сок с протеолитическими ферментами (ананас, киви, папайя, инжир) из расчета 1 мл приливаемой жидкости на 5 мл фильтрата. Подождите 5 мин.
6. Поставьте полученный фильтрат на 5-10 мин в ёмкость со льдом. Это необходимо для того, чтобы, во-первых замедлить процесс деградации ДНК, ее разрушения на фрагменты, а во-вторых, чтобы уменьшить разницу температур при добавлении спирта и не допустить его перемешивания с фильтратом. В это время продолжите заполнять таблицу.
7. Отберите 5 мл охлажденного фильтрата в пробирку. Аккуратно, чтобы не перемешать с воздухом. И также аккуратно и медленно влейте в пробирку 2-3 мл охлажденного этилового спирта. Должен образоваться слой спирта поверх фильтрата, с чёткой границей раздела слоев различной плотности.
8. Сделайте наблюдение за пробиркой. Из компонентов, находящихся в фильтрате, только нуклеиновые кислоты нерастворимы в этаноле, выдержанном в морозильной камере. При добавлении спирта ДНК и РНК изменяют свою пространственную структуру, превращаются в большие конгломераты (комплексы) и выпадает в виде осадка. Этот осадок образуется на границе слоев спирта и фильтрата.
Обратите внимание
В данном опыте мы наблюдаем, как толстые белёсые нити всплывают в спирт. На всех этапах нам нужно по возможности избавляться от пузырьков воздуха в смеси, иначе это затруднит в дальнейшем наблюдение ДНК. Нити ДНК и РНК являются хорошими центрами формирования пузырьков воздуха, поэтому при небрежном выполнении работы в спирт всплывает беловатая бесформенная масса. Всплытие нитей можно ускорить осторожным помешиванием границы слоев стеклянной палочкой.
9. Извлеките из спирта нуклеопротеиды. Для этого намотайте волокнистую массу на деревянную или стеклянную палочку, вращая ее в стакане только в одном направлении. Продемонстрируйте результат опыта учителю.
10. Определите наличие нуклеиновой кислоты в выделенном веществе. Для этого перенесите ½ часть выделенного вещества в чистую пробирку и прилейте 1мл раствора гидроксида натрия (до растворения). Затем добавьте 0,5 мл дифениламинового реактива. Содержимое пробирки перемешайте и нагрейте на кипящей водяной бане в течение 15 – 20 мин. При наличии в пробирке ДНК появляется характерное синее окрашивание, при наличии РНК – зелёное, при наличии обоих нуклеиновых кислот – окрашивание промежуточного цвета (сине-зелёное, в зависимости от соотношения ДНК и РНК).
11. Определите наличие или отсутствие белков в выделенном веществе с помощью биуретовой реакции (на обнаружение пептидной группы). Перенесите другую часть выделенного вещества в чистую пробирку и разведите 1 мл дистиллированной воды. Затем в пробирку внесите 1 мл раствора гидроксида натрия и несколько капель сульфата меди (II). Перемешайте содержимое пробирки. При наличии белков содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовую окраску.
12. Снимите перчатки и завершите заполнение таблицы с описанием хода работы.
Оформление результатов
| Этап работы | Наблюдения | Объяснение результата |
| 1. | ||
| 2. | ||
| … |
Выводы
Сделайте выводы:
1. Удалось ли выделить нуклеиновые кислоты из клеток растений.
2. Содержит выделенное вещество только ДНК, только РНК или смесь нуклеиновых кислот.
3. Содержит ли выделенное вещество белки.
Дополнительная информация
1. Видеолекция «Секреты нуклеиновых кислот. Часть 1»: https://www.youtube.com/watch?v=zsNDloxKW1Y
2. Видеолекция «Секреты нуклеиновых кислот. Часть 2»: https://www.youtube.com/watch?v=Xy2Vj_Xwecw
3. Антипова Н.В., Даянова Л.К., Пахомов А.А. и др. Биохимия. 10-11 классы: учеб. Пособие для общеобразовательных школ. – М.: Просвещение, 2019 – 128 с.
4. Биохимия. Учебник / под ред. Е.С. Северина – М.: Феникс, 2017. – 768 с.