- Приготовление мазка из культуры, выросшей на плотной питательной среде:
1. обезжирить предметное стекло с помощью кусочка мыла;
2. бактериологической петлёй нанести на предметное стекло каплю воды;
3. зажечь спиртовку;
4. взять в разные руки пробирку с культурой и бактериологическую петлю;
5. простерилизовать петлю прокаливанием;
6. возле огня спиртовки открыть пробирку с культурой и обжечь её горлышко;
7. дотронуться петлёй до внутренней поверхности стенки пробирки;
8. дотронуться петлёй до бактериальной культуры с таким расчётом, чтобы на петле оказалось минимальное количество бактериальной массы;
9. вынув из пробирки петлю, обжечь горлышко пробирки и закрыть её пробкой;
10. поставить пробирку в штатив;
11. дотронуться бактериальной петлёй с культурой до капельки воды на предметном стекле с таким расчётом, чтобы капелька помутнела;
12. сжечь оставшуюся на петле бактериальную массу в огне спиртовки;
13. охладить петлю;
14. гомогенизировать каплю на предметном стекле;
15. равномерно распределить гомогенизированную каплю каплю по поверхности предметного стекла до формирования растянутого овала;
16. простерилизовать петлю прокаливанием и поставить её в штатив;
17. подсушить мазок;
18. зафиксировать мазок.
- Приготовление мазка из культуры, выросшей на жидкой питательной среде:
1. обезжирить предметное стекло с помощью кусочка мыла;
2. зажечь спиртовку;
3. взять в разные руки пробирку с культурой и бактериологическую петлю;
4. простерилизовать петлю прокаливанием;
5. возле огня спиртовки открыть пробирку с культурой и обжечь её горлышко;
6. дотронуться петлёй до внутренней поверхности стенки пробирки;
7. взять петлёй каплю бактериальной культуры;
8. вынув из пробирки петлю, обжечь горлышко пробирки и закрыть её пробкой;
9. поставить пробирку в штатив;
10. дотронуться бактериальной петлёй с культурой до предметного стекла с таким расчётом, чтобы перенести на него каплю бактериальной культуры;
11. равномерно распределить каплю бактериальной культуры по поверхности предметного стекла до формирования растянутого овала;
12. простерилизовать петлю прокаливанием и поставить её в штатив;
13. подсушить мазок;
14. зафиксировать мазок.
- Окраска мазка метиленовым синим:
1. метиленовый синий (на фиксированный мазок), 2-4 мин.;
2. промыть водой;
3. просушить фильтровальной бумагой.
- Окраска мазка водным фуксином:
1. водный фуксин (на фиксированный мазок), 1-2 мин.;
2. промыть водой;
3. просушить фильтровальной бумагой.
- Микроскопия мазка с использованием иммерсионной системы:
1. установить правильное освещение, используя малое увеличение;
2. нанести на мазок каплю иммерсионного масла;
3. поместить препарат на предметный столик микроскопа;
4. опустить иммерсионный объектив в каплю иммерсионного масла до момента касания объективом стекла;
5. глядя в окуляр, медленно поднимать объектив с помощью макровинта до момента обнаружения мазка;
6. с помощью микровинта добиться максимально резкого изображения.
- Окраска мазка по Граму:
1. генцианвиолет (на фиксированный мазок), 1-2 минуты;
2. раствор Люголя, 1-2 минуты;
3. промыть водой;
4. спирт, 20 секунд;
5. водный фуксин, 2 минуты;
6. промыть водой;
7. просушить фильтровальной бумагой.
- Идентификация по мазку стафилококка:
точки, располагающиеся грудами.
- Идентификация по мазку стрептококка:
кокки, располагающиеся цепочками.
- Идентификация по мазку палочковидной бактерии:
палочки без каких-либо дополнительных отличительных признаков.
- Окраска мазка по Цилю-Нильсену:
1. фуксин Циля (на фиксированный мазок), нагреть до парения, но не допускать кипения, 5 минут;
2. охладить стекло;
3. промыть водой;
4. кислота, 5 секунд;
5. промыть водой;
6. метиленовый синий, 4 минуты;
7. промыть водой;
8. просушить фильтровальной бумагой.
- Идентификация по мазку бацилл:
крупные палки, образующие цепочки.
- Идентификация по мазку капсульных бактерий:
на окрашенном фоне – неокрашенные ореолы вокруг бактериальных клеток.
- Идентификация по мазку стрептомицетов:
ветвящиеся нити.
- Идентификация по мазку плесневой формы микроскопического грибка:
гифы (на малом увеличении).
- Идентификация по мазку дрожжей и дрожжеподобных грибков:
овальные и круглые большие клетки разного размера (с гетерогенностью внутри).
- Окраска мазка по Нейссеру:
1. синька Нейссера (на фиксированный мазок), 1-2 минуты;
2. раствор Люголя, 1-2 минуты;
3. промыть водой;
4. везувин, 1-2 минуты;
5. промыть водой;
6. просушить фильтровальной бумагой.
- Идентификация по мазку коринебактерий (окрашенные по Нейссеру или по Леффлеру):
палочки с точками.
18. Засев патологического материала на пластинчатый МПА петлей с целью получения отдельных колоний:
1. зажечь спиртовку;
2. взять в разные руки бактериологическую петлю и пробирку с патологическим материалом;
3. простерилизовать петлю прокаливанием;
4. возле огня спиртовки открыть пробирку и обжечь её горлышко;
5. дотронуться петлёй до внутренней поверхности стенки пробирки;
6. взять каплю патологического материала;
7. вынув из пробирки петлю, обжечь горлышко пробирки и закрыть её пробкой;
8. поставить пробирку в штатив;
9. взять чашку Петри с пластинчатым агаром;
10. приоткрыв чашку Петри, нанести петлёй параллельные штрихи на ¼ поверхности агара, после каждого штриха отрывая петлю от поверхности агара;
11. вынуть петлю, закрыть чашку Петри и простерилизовать петлю;
12. приоткрыв чашку Петри, охладить петлю о внутреннюю поверхность крышки;
13. повернув чашку Петри под прямым углом к засеянному сектору, нанести петлёй параллельные штрихи, после каждого штриха отрывая петлю от поверхности агара;
14. повторить пп. 11-13 для засева третьего и четвёртого секторов, в последнем случае – штрихи не доводить до области засева первого сектора;
15. вынуть петлю, закрыть чашку Петри и простерилизовать петлю.
19. Индикация типа колоний (S- или R-) на пластинчатом МПА:
Гомогенные, с ровным краем, влажные – S-колонии; гетерогенные, с неровным краем, сухие – R-колонии.
20. Пересев части колонии на скошенный МПА:
1. простерилизовать бактериологическую петлю;
2. приоткрыв чашку Петри с изолированным ростом, охладить петлю о внутреннюю поверхность крышки;
3. коснуться петлёй нужной колонии, не дотрагиваясь до остальных;
4. вынуть петлю и закрыть чашку Петри;
5. взять пробирку со скошенным агаром;
6. возле огня открыть пробирку и прожечь её горлышко;
7. внести петлю в пробирку и густыми штрихами (или круговыми движениями) засеять поверхность скошенного агара снизу вверх;
8. вынуть петлю из пробирки, прожечь её горлышко и закрыть пробкой;
9. поставить пробирку в штатив;
10. простерилизовать петлю.
21. Пересев бактериальной культуры со скошенного МПА на среду Гисса:
1. взять в разные руки пробирку с культурой на скошенном агаре и бактериологическую петлю;
2. простерилизовать петлю прокаливанием;
3. возле огня спиртовки открыть пробирку и обжечь её горлышко;
4. внести петлю в пробирку, дотронуться ею до внутренней поверхности стенки пробирки;
5. коснуться петлёй бактериальной культуры;
6. вынуть петлю из пробирки, обжечь горлышко пробирки и закрыть её пробкой;
7. поставить пробирку с культурой в штатив и взять пробирку со средой Гисса;
8. возле огня открыть пробирку и обжечь её горлышко;
9. внести петлю в пробирку и засеять среду Гисса уколом, не доводя его до дна пробирки;
10. вынуть петлю, прожечь горлышко пробирки и закрыть её пробкой;
11. простерилизовать петлю и поставить её в штатив;
12. поставить пробирку с засеянной средой Гисса в штатив.
22. Расчёт концентрации бактериофага по методу Грациа:
1. подсчитать количество «бляшек»;
2. умножить на разведение;
3. умножить на 10 (т.к. засевается 0,1 мл);
4. полученное число – количество фаговых частиц в 1 мл исходного материала (т.е. – титр фага).
Пример. Засев 0,1 мл из разведения 10-5 дал 75 «бляшек»; 75 ∙ 105 ∙ 10 = 75 ∙ 106.
23. Обнаружение бактерий в препарате «раздавленная капля».
1. приспустить конденсор для притемнения поле зрения с целью увеличения контрастности;
2. можно использовать как обычный (40х), так иммерсионный (90х, 100х) объективы;
3. бактерии видны, словно нарисованные простым карандашом.
24. Определение вирулентности бактериальной культуры по косвенным признакам (наличие гемолитической активности, наличие лецитиназной активности, наличие плазмокоагулазной активности).
1. гемолитическая активность – зелёный ободок (α-гемолиз) или зона просветления (β-гемолиз) вокруг колонии, выросшей на кровяном агаре;
2. лецитиназная активность – мутный ободок вокруг колонии, выросшей на желточном агаре;
3. плазмокоагулазная активность – образование сгустка в цитратной плазме.
25. Метод дисков для определения устойчивости бактериальной культуры к антибиотикам (проведение и учёт).
1. засев испытуемого штамма на пластинчатый агар газоном;
2. размещение на поверхности засеянного газоном агара дисков с антибиотиками;
3. термостатирование;
4. учёт: чем больше зона задержки роста вокруг диска, тем выше чувствительность к данному антибиотику испытуемого штамма.
26. Метод серийных разведений для определения устойчивости бактериальной культуры к антибиотикам (алгоритм проведения, вычисление МИК и МБК).
1. последовательное разведение антибиотика в жидкой питательной среде;
2. засев пробирок с последовательно уменьшающейся концентрацией антибиотика в питательной среде испытуемым штаммом;
3. термостатирование;
4. учёт опыта с определением МИК – наибольшего разведения (т.е. наименьшей концентрации) антибиотика в питательной среде, при которой отсутствует рост тестируемого штамма;
5. засев материала из тех пробирок, в которых нет роста, на пластинчатый агар без антибиотика;
6. термостатирование;
7. учёт опыта с определением МБК – наибольшего разведения (т.е. наименьшей концентрации) антибиотика в питательной среде, при которой тестируемого штамм теряет способность к росту на среде без антибиотика.
27. Определение титра лизоцима в слюне (алгоритм проведения и оценка результата):
1. последовательное разведение слюны в МПБ;
2. засев этих разведений чувствительным к лизоциму бактериальным штаммом.
3. термостатирование.
4. учёт опыта – титр лизоцима равен максимальному разведению, препятствующему росту тест-штамма.
28. Вычисление по мазку фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса:
1. смешивание крови с тест-культурой (например, стафилококка);
2. термостатирование в течение 30 минут;
3. приготовление и окраска мазка;
4. микроскопия мазка с подсчётом
а. фагоцитарного числа (среднего числа микробов, поглощённого одним нейтрофилом, для чего в определённом числе попавших в поле зрения нейтрофилов подсчитывается количество микробных тел, и эта сумма делится на число просмотренных нейтрофилов),
б. фагоцитарного индекса (относительное количество нейтрофилов, в %, участвующих в фагоцитозе – для его вычисления количество нейтрофилов, содержащих в цитоплазме тест-микробы, выражают в процентах к общему числу просмотренных нейтрофилов).
- Определение активности системы комплемента (алгоритм проведения и оценка результата).
1. последовательное разведение раствора, содержащего комплемент (например, сыворотки крови);
2. добавление в каждое разведение гемсистемы (эритроцитов барана и инактивированной сыворотки кролика, иммунизированного эритроцитами барана);
3. термостатирование в течение 30 минут;
4. учёт реакции – титр (=активность) комплемента равен максимальному его разведению, в котором наблюдается гемолиз.
- Проведение и учёт пластинчатой реакции агглютинации на стекле.
На предметное стекло наносят каплю диагностической сыворотки.
В ней гомогенизируют идентифицируемую культуру.
Учёт:
положительная реакция – формируется агглютинат;
отрицательная реакция – капля остаётся гомогенно-мутной.
- Проведение и учёт объёмной реакции агглютинации для определения титра антител.
1. приготовление двукратных разведений испытуемой сыворотки (титрование), не обязательно беря начальным 1:2, например – 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1: 1600 и т.д.;
2. добавление во все разведения 2 капель диагностикума;
3. термостатирование;
4. учёт – при наличии агглютинатов в разведениях сыворотки реакция считается положительной, а наибольшее разведение с наличием агглютината равно титру сыворотки (т.е. концентрации в ней антител против антигена диагностикума).
- Проведение и учёт реакции преципитации по Асколи.
в пробирке на диагностическую сыворотку медленно и осторожно, по каплям, наслаивается идентифицируемый антиген;
учёт – в положительном случае на границе сыворотки и раствора антигена появляется мутная полоска/кольцо.
- Учёт реакции преципитации по Манчини.
на специальное стекло тонким слоем наносится гель с одним из компонентов реакции;
в слое геле делаются микролунки;
в лунки вносится исследуемый раствор с вероятным содержанием второго компонента реакции;
учёт – в положительном случае вокруг лунки появляется зона преципитации, диаметр которой прямо пропорционален количеству внесённого в данную лунку компонента реакции.
- Постановка и учёт реакции связывания комплемента.
А. Формирование тест системы.
№ пробирки/лунки | |||||||
назначение | опыт | положит. контроль | отрицат. контроль | контроль исп. сыворотки | контроль антигена | контроль комплемента | контроль гем. системы |
1 объём | исп. сыв-ка | положит. сыв-ка | отрицат. сыв-ка | исп. сыв-ка | физ. р-р | физ. р-р | физ. р-р |
2 объём | Ag | Ag | Ag | физ. р-р | Ag | физ. р-р | физ. р-р |
3 объём | С | С | С | С | С | С | физ. р-р |
термостатирование
Б. Визуализация реакции.
добавление гемсистемы | гем. система | гем. система | гем. система | гем. система | гем. система | гем. система | гем. система |
термостатирование
В. Учёт реакции.
наличие гемолиза | +/– | – | + | + | + | + | – |
РСК | –/+ |
- Расшифровка показателей иммунограммы.
Показатель | Характеристика | ||
CD3 | количество Т-лимфоцитов | ||
CD4 | количество Т-хелперов | ||
CD8 | количество ЦТЛ и др. Т-лимфоцитов CD8-субпопуляции | ||
CD16 | количество NK-клеток | ||
CD19 (CD20, CD22) | количество В-лимфоцитов | ||
CD25 | количество активированных лимфоцитов | ||
CD95 | количество терминально активированных лимфоцитов, готовых к апоптозу | ||
ИРИ CD4/CD8 | удельное содержание Т-хелперов среди всех Т-лимфоцитов | ||
ФЧ | поглотительная способность нейтрофилов | ||
ФИ | количество фагоцитирующих нейтрофилов (фагоцитарная активность нейтрофилов) | ||
CH50 | количество/активность комплимента | ||
ЦИК | активность фагоцитов, склонность к развитию аллергии III типа | ||
НСТ-тест | завершённость фагоцитоза | ||
IgM | количество иммуноглобулинов класса М | ||
IgG | количество иммуноглобулинов класса G | ||
IgA | количество иммуноглобулинов класса А | ||
РБТЛ | ФГА | пролиферативная активность Т-лимфоцитов | |
ЛПС | пролиферативная активность В-лимфоцитов | ||
КонА | пролиферативная активность Т-лимфоцитов |
Расшифруйте сокращения:
CD - кластеры дифференциации (CD-молекулы)
ИРИ - иммуно-регуляторный комплекс
ФЧ - фагоцитарное число
ФИ - фагоцитарный индекс
CH50 - гемолитическая активность сыворотки
ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы
НСТ - тест с нитро синим тетразолием
Ig - иммуноглобулины (антитела)
РБТЛ - реакция бласт-трансформации лимфоцитов
ФГА - фитогемагглютинин
ЛПС - липополисахарид
КонА - конканавалин А
- Учёт реакции иммунофенотипирования лимфоцитов.
1. Кровь обрабатывается моноклональным антительным диагностикумом к определяемой CD-молекуле.
2. При микроскопии мазка подсчитывается количество лимфоцитов, на которых адсорбированы три и более эритроцита.
3. Такие лимфоциты являются носителями определяемой CD-молекулы.
- Иммунопрепараты.
Ориентироваться по надписям на коробке, самих ампулах/флаконах, вложенных инструкциях и т.п.
38. Выявление в мазке из уретрального гноя гонококка или в мазке из осадка ликвора – менингококка.
Клетки с кокками в цитоплазме.
39. Алгоритм проведения и учёт фаготипирования бактериальной культуры.
1. засев газоном
2. нанесение в соответствующие подписанные квадраты капель типовых фагов
3. термостатирование
4. к тем фагам, в местах нанесения которых видны бляшки (отсутствие роста), культура чувствительна; перечень этих фагов – фаготип.
40. Дифференциация лактозопозитивных и лактозонегативных колоний на дифференциально-диагностических средах (Эндо, Левина, Плоскирева).
Лактозопозитивные – цветные, лактозонегативные – бесцветные (под цвет среды).
41. Засев скошенного агара по Щукевичу.
Засев в каплю конденсационной воды, не касаясь петлёй поверхности агара; если есть протей – он поднимется почти до самой верхней точки поверхности скошенного агара (по типу запотевания).
42. Обнаружение в мазках из мокроты, окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерий.
Красные бактерии в окружении всего синего.
43. Идентификация клостридий по мазку.
Палочки с пузырьками.
44. Учёт реакции непрямой гемагглютинации.
«розетка» – положительная,
«пуговка» – отрицательная.
45. Учёт реакции гемагглютинации.
«розетка» – положительная,
«пуговка» – отрицательная.
46. Учёт реакции торможения гемагглютинации.
«розетка» – отрицательная,
«пуговка» – положительная.