ЗАНЯТИЕ 1.3.5
СИСТЕМА АНТИГЕН-АНТИТЕЛО В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)
Цель: изучить механизмы взаимодействия АГ-АТ, принципы и методы постановки РСК, РИФ, ИФА.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
- РСК. Механизм, компоненты, применение.
- РИФ. Механизм, компоненты, применение.
- ИФА, иммуноблоттинг. Механизм, компоненты, применение.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
· интерпретировать результаты серологических исследований.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:
о существовании различных модификаций серологических реакций, усиливающих их чувствительность (информативность).
Работа № 1. Реакция связывания комплемента (РСК)
Цель: Разобрать механизм, освоить различные методы постановки РСК в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
Самостоятельная работа. Учесть результат РСК, поставленной с целью идентификации возбудителя.
Направление:
Ингредиенты:
I. Опытная система:
1)
2)
3)
4)
Через 30 минут:
II. Индикаторная система:
1)
2)
Механизм:
Постановка:
| Ингредиенты | Опыт | КАТ | КАГ | КС | Индикаторная система - ГС |
| АГ | |||||
| АТ | |||||
| С | |||||
| Физ. раствор | |||||
| ЭР (АГ) | |||||
| ГС (АТ) |
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Самостоятельная работа. Оценить результат РСК, с целью выявления комплементсвязывающих АТ в парных сыворотках больного
Направление:
Ингредиенты:
I. Опытная система:
1)
2)
3)
4)
Через 30 минут:
II. Индикаторная система:
1)
2)
Механизм (см. схему выше):
Постановка:
Iнеделя
II неделя
1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 КС КД КГС
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 2. Реакция иммунной флюоресценции (РИФ)
Цель: Разобрать механизм, освоить различные методы постановки РИФ в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
Самостоятельная работа. Прямой метод постановки РИФ.Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм:
Постановка:
Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Самостоятельная работа. Непрямой метод постановки РИФ. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
4)
Механизм:
Постановка:
Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 3. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Цель: Разобрать механизм, освоить различные методы постановки ИФА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
Самостоятельная работа. Прямой метод постановки ИФА. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
4)
5)
Механизм:
Постановка:
«О» «КН» «КП»
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Самостоятельная работа. Непрямой метод постановки ИФА. Разобрать реакцию в соответствии с предложенной схемой.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
4)
5)
Механизм:
Постановка:
I неделя
IIнеделя
1/14 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 «КН» «КП»
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Теоретическая справка
Реакции иммунного лизиса
Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.
Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты и другие клетки.
2.Антитела (лизины) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериологическая сыворотка содержит антитела, лизирующие бактерии, гемолитическая -гемолизины, способствующие лизису эритроцитов, лизис спирохет вызывают спирохетолизины, клеток - цитолизины и т. д. Титр гемолитической сыворотки - ее наибольшее разведение, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента 1:10.
3. Комплемент - неспецифический белок, содержащийся в сывороткечеловека и теплокровных животных. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок.
Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не позже 1-2-го дня после получения. Консервированный комплемент (на 10 мл сыворотки 0,2 г борной кислоты и 0,3 г сульфата натрия) сохраняется при 4°С до 2 недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют изотоническим раствором хлорида натрия до первоначального объема, указанного на этикетке.
4. Изотонический раствор хлорида натрия.
Работа № 1
Реакция связывания комплемента (РСК)
Реакция связывания комплемента протекает в 2 фазы. В первой (специфической) взаимодействуют антиген, антитело и комплемент. Если антиген соответствует антителу, они соединяются и образуют комплекс, который связывает комплемент. Образовавшееся соединение внешне не проявляется. Об его образовании узнают с помощью индикатора, которым является гемолитическая система, участвующая во второй (индикаторной) фазе реакции. Гемолитическая система состоит из эритроцитов барана и соответствующей гемолитической сыворотки. Гемолитическая сыворотка, реагируя с эритроцитами, делает их чувствительными (сенсибилизирует) к действию комплемента, в присутствии которого эритроциты разрушаются (лизируются). Если лизиса нет, комплемент связан первой системой и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу. Отсутствие гемолиза регистрируют как положительный ответ. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Свободный комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз эритроцитов, результат РСК при этом отрицательный.
Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому, постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.
В РСК используют:
1. Прогретую (инактивированную) сыворотку при 56°С в течение 30 мин, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Обычно сыворотку больного применяют в разведении 1:5-1:10, иммунные (диагностические) сыворотки – в разведении 1:50 и более.
2. Диагностикум.
3. Комплемент в рабочей дозе. Перед опытом С обычно титруют, т. е. определяют наименьшее его количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С. Титруют С по схеме.
4. Эритроциты барана. Используют 3% взвесь отмытых эритроцитов барана.
5. Гемолитическая сыворотка.
В РСК применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки составляет 1/200, то рабочее разведение сыворотки составляет 1/400, следовательно, к 0,1 мл гемолитической сыворотки следует добавить 39,9 мл изотонического раствора хлорида натрия.
Работа № 2