Исследование антимикробной активности коммерческих таниновых препаратов

Материалы и методы

Антибактериальная активность танинов (Фарматан, Кебрачо, Фарматан жидкий, Фарматан жидкий плюс) была протестирована на штаммах Salmonella Typhimurium ATCC 14028, S. Enteritidis (клинический изолят фекалий домашней птицы) и S. Enteritidis ATCC 13076. Клинический изолят, использованный в данном исследовании, был изолирован из клинического материала, представленного для исследования в лаборатории бактериологии кафедры микробиологии Белградского университета.

Бульон Мюллера-Хинтона II с скорректированным количеством ионов кальция и магния (бульон Мюллера-Хинтона с поправкой на катионы, CAMHB, Becton Dickinson) использовали для исследования антибактериальной активности танинов. Для определения значений MIC (минимальной ингибирующей концентрации) в соответствии с предписанием CLSI 2008 г. (Институт клинических лабораторных стандартов, США) использовали метод микроразбавления бульона.

Исследована антибактериальная активность танинов в концентрациях 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 и 0,625 мг / мл. Метод выполнялся в планшетах для микротитрования с плоским дном (Sarstedt). Все испытанные препараты танинов предварительно растворяли в стерильной дистиллированной воде. Требуемая плотность инокулума тестовых штаммов 5х10⁵ КОЕ / мл была достигнута путем использования сначала стандартной суспензии бактерий по шкале МакФарланда (Becton Dickinson) с плотностью приблизительно 1-2х10⁸ КОЕ / мл, разведенной в 20 раз (1-2х10⁶ бактерий / мл), и 10 мл этой суспензии засевали в лунки 100 мл CAMHB. Таким образом была достигнута конечная концентрация инокулума 5х10⁵ / мл или 5х10⁴ / лунка. Инкубацию проводили 18-24 ч при 37 ° C. В качестве значения MIC для танинов была взята самая низкая концентрация дубильных веществ, при которой не было видимого роста бактерий.

Препарат «Фарматан жидкий плюс» дал неадекватные (неразборчивые) результаты в методе микроразбавления бульона из-за его сильного (темного) цвета и сильного осадка в концентрациях 640 мл и более. Следовательно, для определения значения MIC этого препарата необходимо было использовать метод разбавления в агаре, также в соответствии с рекомендациями CLSI 2008 года. В этом случае (для метода разбавления в агаре) препарат «Фарматан жидкий плюс» растворяли в DMSO (диметилсульфоксид, Serva).

В методе разведения в агаре использовался агар Миллера-Хинтона, в котором препарат (танин) был предварительно растворен в определенной концентрации. Это твердая питательная среда, в которой тестируемый препарат был суспендирован, пока среда все еще находилась в жидком (растворенном) состоянии. За ростом тест-бактерий (или их отсутствием) на среде следили, на основании чего определяли значение MIC препарата «Фарматан жидкий плюс». Качество этого метода часто оспаривается в профессиональной и научной литературе, поскольку считается, что микроорганизмы не имеют достаточно хорошего контакта с растворенным веществом из субстрата. Дело в том, что все значения MIC, полученные методом разведения в агаре, в 1-2 раза выше, чем значения MIC, полученные в методе микроразбавления в бульоне или Е-тесте.

После стерилизации в автоклаве MH агар охлаждали на водяной бане при температуре 50-60 ° C. Когда субстрат достиг температуры водяной бани, в него добавляли раствор танина. Сначала танин растворяли в количестве 128 мг / 2 мл AD. Следовательно, это составляло 64 мг / мл. Было выполнено последовательное двойное разведение исходной концентрации. Таким образом были получены растворы 64, 32, 16, 8, 4, 2 мг / мл. Охлажденную до примерно 50 ° C среду разливали в пробирки на 9 мл с 1 мл каждой приготовленной концентрации танина, а затем сразу же выливали в чашки Петри с этикетками. Конечные значения таннина в среде (тест) составляли 6400 мг / м (6,4 мг / мл), 3200 (3,2 мг / мл), 1600, 800, 400, 200 и 100 мг / мл. Инокулум был приготовлен путем ресуспендирования тестируемых колоний в стерильном физиологическом растворе до мутности, соответствующей стандарту шкалы Макфарланда 0,5 (1 × 10⁸ мл) (1 × 10⁸ / мл). Исходную суспензию разбавляли в 10 раз до 1х10⁷ / мл. 1 мл этой суспензии высевали на поверхность среды, таким образом достигнув конечного (необходимого) количества бактерий на поверхности агара 1х10⁴. За значение MIC принимали чашку с концентрацией антибиотиков, на которой не было увеличения.

Результаты:

Приведены в таблице.

Фарматан оказывал умеренно сильное (MIC = 320-640 мкг / мл) или слабое действие на тестируемую сальмонеллу (MIC 1280 мкг / мл).

Препарат Кебрачо оказал слабое действие со значениями MIC 1280-2560 мкг / мл.

Препарат Фарматан Жидкий плюс обладал средне сильным действием с полученными значениями MIC 400-800 мкг / мл.

A: результаты недействительны!

Дискуссия:

В научной литературе уже много лет ведутся споры о том, что будет «сильным», а что «средне-сильным» и «слабым» действием природных веществ (экстрактов растений и других биоактивных молекул). В большинстве научных работ, при изучении антибактериального действия некоторых природных молекул, контроль устанавливается с помощью антибиотиков (сравнивая действие экстракта с антибиотиком), что, на мой взгляд (в некоторых статьях это открыто обсуждается, например, доктор Душан Мишич) совершенно неправильно. Антибиотик нельзя сравнивать с растением, потому что химически, по происхождению, а также по механизму действия они представляют собой совершенно разные типы химических соединений. Итак, если мы сравним действие этих танинов с антибиотиками, танины работают «слабо», потому что антибиотики действуют в концентрациях менее 1 мкг / мл или максимум 1-4 мкг / мл. Вот почему был составлен этот график проверенных концентраций танинов, который включает эти «антибиотические показатели», чтобы увидеть, как работают танины / сравнение с антибиотиками /. Однако, хотя в этом случае танины действуют в гораздо более высоких концентрациях, чем антибиотики, необходимо подчеркнуть, что при ТОЙ концентрации, которая соответствует значению MIC, они убивают сальмонеллу, и поэтому может быть достигнут конечный эффект (антисальмонеллезное действие), даже если они не являются антибиотиками.